Fluoreszenzmikroskopie

Die Fluoreszenzmikroskopie stellt eine hocheffektive Methode der Lichtmikroskopie zur Untersuchung von Euzyten, Protozyten, Mitochondrien, Proteinen, Molekülen, Allergenen, Bakterien, Mykosen (Pilze), Apoptosen, Tumoren und anderen biologischen Strukturen bzw. Vorgängen dar. Bei der Absorption von Licht einer bestimmten Wellenlänge (Anregungslicht) ist bei verschiedenen Molekülen eine gleichzeitige Emission von Licht mit größerer Wellenlänge zu beobachten. Dieses Verhalten (Absorption von kurzwelligem Licht, Emission von langwelligem Licht) wird als Fluoreszenz bezeichnet. Bei modernen Fluoreszenzmikroskopen arbeitet man in der Regel mit dem Auflichtverfahren, da hier die Fluoreszenzen heller im mikroskopischen Bild erscheinen und das Anregungslicht noch besser eliminiert werden kann. Allerdings erfordern manche Analysen die Anregung einer Fluoreszenz im Durchlichtverfahren. Häufig möchte man sogar zwischen beiden Verfahren innerhalb kürzester Zeit umschalten können.

Das neue, invertierte Fluoreszenz-Phasenkontrast-Mikroskop Biozero aus der Modellreihe BZ-8000 des Unternehmens Keyence, bietet daher sowohl das Auflicht- wie das Durchlichtverfahren und eine beliebige Kombination beider Prinzipien an. Mit Hilfe von verschiedenen Spiegeln lässt sich die Auflicht- und Durchlichtbeleuchtung, deren Übertragungswege sowie das dazugehörige Vergrößerungssystem im jeweils optimalen Winkel (Patent angemeldet) so anordnen, dass ein sehr kompaktes Modell mit stufenlos einstellbarem optischen System zur Verfügung steht. Konkret bedeutet dies, dass dieses innovative Fluoreszenzmikroskop nur eine Stellfläche von 30,5 × 43,2 cm benötigt. Trotzdem bietet es 3 verschiedene Betrachtungsarten (Hellfeld-, Fluoreszenz- und Phasenkontrastbetrachtung), zwischen denen mit einem einzigen Mausklick umgeschaltet werden kann.

Die sehr kompakte Konstruktion geht jedoch nicht zu Lasten der Bedienbarkeit. So weist dieses Fluoreszenzmikroskop einen eingebauten Dunkelraum mit integriertem X-Y-Z-Koordinatentisch sowie einen vollautomatischen Filterwechsler auf. Damit ist der Anwender in der Lage, die zu untersuchende Probe ohne störenden Einfluss von außen nach Belieben zu positionieren, mittels verschiedener Filter differenziert zu analysieren und durch Auflicht/Durchlicht unterschiedlich zu beleuchten. Der optische Zoom nutzt die volle Auflösung des Objektivs und ermöglicht dadurch Vergrößerungen bis 60fach. Mittels des integrierten Digitalzooms sind zusätzlich Vergrößerungen im Bereich 0,5...3fach möglich. Die elektronische Ansteuerung unterstützt den Benutzer bei der optimalen Einstellung und erlaubt ein schnelles Reproduzieren von Analysen. Wird die Betrachtung unterbrochen, so schließt sich automatisch die Blende für das Anregungslicht. Dadurch wird ein ungewolltes Verblassen der fluoreszierenden Probe und deren weitere Beeinflussung verhindert.

Eine möglichst vollständige Trennung von Anregungs- und Fluoreszenzlicht durch das optische System stellt eine Grundvoraussetzung für eine gute Abbildung in der Fluoreszenzmikroskopie dar. Je nach Untersuchungsobjekt sowie verwendetem Fluoreszenzfarbstoff gilt es spezielle Filtereinsätze mit geeigneten Kombinationen von Filtern und dichromatischen Spiegeln einzusetzen. Bis zu 4 Filtersysteme (Erregungsfilter, Absorptionsfilter, dichroitische Spiegel) lassen sich beim Biozero vorab montieren und mittels der elektronischen Steuerung bei Bedarf aktivieren oder deaktivieren. Ein vollautomatischer Filterwechsel ist nicht nur direkt am Mikroskop, vielmehr auch über einen angeschlossenen Computer möglich.

Bei der Konstruktion des Biozero wurden zahlreiche Anwenderforderungen bestmöglich umgesetzt. So besteht das Gehäuse aus einer unteren und oberen Hälfte, die beide von einem Kühlgebläse effektiv gekühlt werden. Selbst bei einer Lichtunterbrechung bleibt der Temperaturanstieg auch innerhalb des Probenraums auf maximal 3 °C begrenzt. Ein spezielles Vibrationsschutzmaterial wiederum dämpft den Mikroskopteil, weswegen Vibrationen, beispielsweise vom Kühlgebläse verursacht, keinen Einfluss auf die vorzunehmenden Messungen/Analysen haben. Spezielle Füße sorgen für die notwendige Dämpfung von äußeren Schwingungs­einflüssen.

Die Lebensdauer der Quecksilberlampe wurde auf 2000 Betriebsstunden erhöht. Sie lässt sich bei Bedarf sehr einfach austauschen. Im Gegensatz zu marktüblichen Mikroskopen müssen die Strahlachsen dazu nicht demontiert und nachher wieder montiert und neu ausgerichtet werden. Eine zusätzliche 100-W-Halogenlampe ermöglicht zudem, die Einsatzzeit der Quecksilberlampe weiter zu reduzieren, so dass diese dann noch länger haltbar ist.

Die Durchlichtbeleuchtungseinheit lässt sich einfach aufklappen, um Proben oder Objekte leichter auszutauschen. Eine eingebaute Gasdruckfeder verhindert das versehentliche Herunterfallen durch ihr Eigengewicht. Beim Hochheben der Einheit wird die Beleuchtung aus Sicherheitsgründen automatisch ausgeschaltet. Verschiedene Objektträger wie solche aus Glas, Kunststoff-Petrischalen, Multi-Well-Platten und Schalen mit Glasboden können verwendet werden.

Verschiedene Regelalgorithmen sowie Softwarefunktionen unterstützen den Bediener nicht nur höchst effizient bei den Untersuchungen, sie bieten zudem eine neue Qualität bei der Analyse und deren Visualisierung. Durch die Beseitigung unscharfer (verschwommener) Bereiche am Objektiv lässt sich der Bildkontrast verstärken, wodurch die Qualität der Bilder wesentlich erhöht wird. Die Verarbeitungsgeschwindigkeit des Modells Biozero ist etwa 30 Mal höher als bei herkömmlichen Mikroskopen. Dies garantiert qualitativ hochwertige Bilder ohne Erzeugung von Artefakten. Die Unschärfereduktion kann am Bild selbstverständlich in Echtzeit durchgeführt werden.

Das Biozero weist eine höhere Bildqualität als beim NN-(Nearest Neighbor-)Verfahren auf, bei dem zur Beseitigung von Unschärfen die Daten dreier unterschiedlicher Bilder entlang der Z-Achse berechnet werden. Im Gegesatz zum PSF-(Point Spread Function-)Verfahren müssen die Daten nicht für jedes Objekt gesammelt werden. Es bietet eine rund 30 Mal schnellere Verarbeitung als bei der iterativen Methode, bei der zur Erstellung von Bildern mit geringerem Unschärfeanteil eine graduelle Korrektur der Abweichungen vorgenommen wird.

Die Vorteile gegenüber konfokalen Mikroskopen sind ebenfalls recht überzeugend, denn das Biozero beeinflusst/beschädigt die Probe auf Grund geringerer Objekterregungen sehr viel weniger. Die gewünschte Erregungswellenlänge lässt sich zudem durch einen schnellen Filterwechsel individuell auswählen. Darüber hinaus weist es gegenüber herkömlichen Mikroskopen ein geringeres Rauschen auf, es baut zudem sehr kompakt und ist vergleichsweise kostengünstig.

Bei Bedarf lassen sich selbst 3D-Analysen in Echtzeit erstellen. Durch Steuerung der Z-Achse des Objekttisches zur Verschiebung der Fokusposition können Bilder verschiedener Z-Positionen generiert werden, aus denen sich ­anschließend ein 3D-Bild erstellen lässt. Dank eines ausgeklügelten ­Algorithmus mit OpenGL² kann das 3D-Bild sehr rasch durch ein so genanntes Volume Rendering Verfahren (Visualisierung der Helligkeitsebenen von Punkten/Voxel in einem 3D-Raum) gezeichnet werden. Obwohl dieses Verfahren sehr speicherintensiv ist, erhält der Anwender dank hoher Leistungsfähigkeit der eingebauten Grafikkarte ein schnelles, verzerrungsfreies 3D-Ergebnis. Neben 3D-Rotationen und beliebigen 3D-Vergrößerungen vermag der Benutzer auch Echtzeit-Farbextraktionen sowie Echtzeit-Kontrastextraktionen an den 3D-Bildern vorzunehmen.

Ebenso rasch und einfach lassen sich verschiedene Kameraeinstellungen vornehmen. Mit nur einem einzigen Mausklick vermag man die Kamera zu positionieren, wofür herkömmliche Fluoreszenzmikroskope in der Regel zahlreiche Arbeitsschritte benötigen. So lassen sich Bilder, die mit unterschiedlichen Betrachtungsmodi erzeugt wurden, am vierfach geteilten Bildschirm von Kanal 1 bis 4 schnell anzeigen. Durch Anklicken des jeweiligen Bildschirmabschnitts vom gewünschten Kanal ist ein rasches Umschalten innerhalb der 4 Anzeigen möglich. Die Anwenderfreundlichkeit wird dadurch noch gesteigert, dass sich mehrere Bildaufnahmebedingungen gleichzeitig verändern lassen.

Zahlreiche Messfunktionen, einfache, aber effektive Bild-Farbton-, Bild-Sättigungs- sowie Bild-Helligkeitseinstellungen lassen sich ebenso komfortabel durchführen wie die Darstellung von Messlinienverläufen und diverse Statistiken. Über eine Firewire-Schnittstelle (IEEE1394) können die Daten auf einen Computer übertragen und darüber auch das neue Fluoreszenzmikroskop gesteuert werden.

Das invertierte Fluoreszenz-Phasenkontrast-Mikroskop Biozero dürfte rasch zum neuen Standard bei der Fluoreszenz-Betrachtung werden. Nicht zuletzt auf Grund der hohen Leistung, den kompakten Abmessungen und der umfassenden sowie ausgeklügelten Funktionsvielfalt. Dass dann noch der Preis stimmt, dürfte so manch schmalem Forschungsbudget sicherlich ganz gut tun.