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Interkalierende Fluoreszenzfarbstoffe - Verschiedene Kits, enorme Variabilität

Interkalierende FluoreszenzfarbstoffeVerschiedene Kits, enorme Variabilität

Die Verwendung interkalierender Farbstoffe für Quantifizierungs-Assays ist eine der beliebtesten und meist verbreitetsten Real-Time PCR Applikationen in molekularbiologisch arbeitenden Laboren. SYBR® Green oder EvaGreen® sind beispielsweise sehr einfach und universell einsetzbar. Dementsprechend sind eine Vielzahl an gebrauchsfertigen Master Mixen verfügbar. Sie sollen Workflows weitestgehend vereinfachen, mögliche Fehler minimieren und das Erzielen homogener Ergebnisse unterstützen. Der Master Mix-Vergleich unter Nutzung des Real-Time Thermocycler qTOWER³ (Analytik Jena) beweist, dass der Einflussfaktor Chemie und hier insbesondere der von Ready-to-Use Kits enorm wichtig und nicht zu unterschätzten ist.

Struktur von SYBR® Green

Interkalierende Dyes in der Real-Time qPCR
Die einfachste und schnellste Möglichkeit zur Durchführung einer quantitativen Real-Time PCR ist die Verwendung von fluoreszierenden Molekülen (Fluoreszenzfarbstoffe), welche in doppelsträngige DNA interkalieren und so detektierbar werden [1]. Frei in Lösung ist die Fluoreszenzemission sehr gering. Diese nimmt jedoch nach Einlagerung in die DNA stark zu und steht in Korrelation zur DNA-Zunahme im Reaktionsgemisch. [2] Die Fluoreszenz steigt dabei direkt proportional zur Menge der PCR-Produkte an und erlaubt somit die online Detektion der Amplifikation bei direkter Quantifizierung [3].

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Eindrucksvoller Vergleich unterschiedlicher Master Mixe
Um die Performance sechs verschiedener kommerziell erhältlicher Master Mixe zu vergleichen, wurde der 96 Well Real-Time Thermocycler qTOWER³ (Analytik Jena, Bild 2) eingesetzt. Amplifiziert wurde humanes GAPDH in je 20 µl PCR-Reaktionsgemisch und vier technischen Replikaten. Die Template-Konzentration wurde auf 0,1 ng/µl eingestellt und je 0,5 µM spezifischer Forward und Reverse Primer zugegeben. Ein gezielt auf die eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe abgestimmtes Farbfiltermodul (Analytik Jena) mit einer Anregung von 470 nm und einer Emission von 520 nm wurde für den Assay mittels qTOWER³ angewendet. Die Detektion der ansteigenden Fluoreszenzsignale wird in jedem der 45 Zyklen im Anschluss an die Elongationsphase in Echtzeit gemessen und ausgegeben. Die PCR-Produkte wurden final mittels Schmelzkurvenanalyse bewertet (Tabelle 1).

qTOWER³

Einfluss auf Ct-Werte und Schmelztemperaturen
Die in Bild 3 gezeigten Real-Time PCR-Plots und die zugehörigen Schmelzkurven wurden mittels Kontroll- und Auswertesoftware qPCRsoft 3.1 (Analytik Jena) aufgenommen und analysiert. Dabei erfolgte die Bestimmung der Ct-Werte und der Schmelztemperaturen (Bild 3) vollautomatisiert. Anhand der Amplifikation humanen GAPDHs in Abhängigkeit des eingesetzten Ready-to-Use Master Mixes mit interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffen werden die enormen Unterschiede in den Ct-Werten insbesondere jedoch zwischen den Schmelzpunkten deutlich.

Im Vergleich erreicht der innuMIX qPCR MasterMix SyGreen (Analytik Jena) (Nr. 1 in Tab. 2) die besten Resultate, dicht gefolgt von Hersteller B (3). Unter den eingestellten Bedingungen führte die Verwendung von Hersteller BR (5) zur Ausbildung von Primer Dimeren und ungewollten Nebenprodukten. Hersteller EG (2) und BS (6) erzielten keine und F (4) geringere Detektionssignale im gezeigten qPCR-Assay. Ebenso werden einige salzabhängige Verschiebungen in der Amplikon-spezifischen Schmelzkurve sichtbar (4, 5).

Amplifikation des humanen GAPDH-Gens

Die Kombination aus qTOWER³ und dem innuMIX qPCR MasterMix SyGreen erlaubt qPCR-Amplifikationen mit idealer Reproduzierbarkeit. Des Weiteren zeigt die Schmelzkurvenanalyse, dass unspezifische Neben-produkte effizient vermieden werden können. Resultierend daraus sollte neben dem Design eines optimalen Primerpaares ebenso die Wahl der idealen Amplifikationschemie eine wichtige Stellung im Setup von qPCR-Assays einnehmen.

Literatur
[1] Michael Wink, Molekulare Biotechnologie, Konzepte Methoden und Anwendungen, 2., aktualisierte Auflage, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA [2011].
[2] B. Neumeister, H.K. Geiss, R.W. Braun, P. Kimmig, Mikrobiologische Diagnostik, 2. Vollständig überarbeitete Auflage, Thieme Verlag KG, [2009].
[3] http://www.meduniwien.ac.at/appliedimmunology/praes_labm-ws2013-14/short/6_Kliman-Realtime%20PCR.pdf [29.10.2015].
[4] https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/c9/SYBR_Green_I.png [29.10.2015].

Autorinnen:
Melanie Kelm, Melanie Jahn, Martina Pick
Analytik Jena AG
Business Unit Life Science
Jena
lifescience@analytik-jena.de
www.bio.analytik-jena.de

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