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FachbeitragImmer besser, immer schneller...

Chromatographie ist wegen des zugrunde liegenden physikalisch-chemischen Wirkungsprinzips ein Trennprozess, der eine gewisse Zeit erfordert. Die Van Deemter-Diagramme (Bild 1) zeigen, dass es für jedes Sorbens-Eluens-Trennsystem eine optimale Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase gibt, bei der die höchste Peakauflösung und damit die höchste Trennleistung erreicht wird. Bei Standard-Reversed-Phase-Säulen liegt dieses Optimum bei einer Fließgeschwindigkeit von ca. 1 ml/min. Bei weiterer Erhöhung der Fließgeschwindigkeit nimmt die Trennleistung der Chromatographie-Säule ab. Der Grund dafür ist, dass für den erforderlichen Massentransfer, d.h. die Diffusion der Moleküle von der mobilen Phase in die stationäre Phase und nach der Wechselwirkung mit der stationären Phase wieder zurück in die mobile Phase, nicht genügend Zeit zur Verfügung steht. Daher sind der Beschleunigung der chromatographischen Analyse durch Erhöhung der Fließgeschwindigkeit prinzipielle Grenzen gesetzt.

Fachbeitrag: Immer besser, immer schneller...

In den letzten Jahren wurden jedoch Sorbentien mit speziellen Eigenschaften entwickelt, bei denen der Anstieg des Massentransfer-Terms der Van-Deemter-Kurve mit der Fließgeschwindigkeit sehr flach verläuft. Damit kann die Fließgeschwindikeit des Eluens erhöht werden, ohne nennenswert an Trennleistung und Peakauflösung zu verlieren. Generell ist die Ursache hierfür die Beschleunigung des Massentransfers der zu trennenden Moleküle. Bei der Entwicklung von Säulen mit diesen Eigenschaften wurden bisher zwei Ansätze verfolgt: 1. Die Entwicklung silika-basierender monolithischer Trennsäulen. Ihre für den Trennprozess verantwortlichen sogenannten Mesoporen weisen eine nur sehr geringe Tiefe auf, wodurch die Massentransfer-Diffusionsprozesse sehr schnell stattfinden können. Diese Chromolith®-Säulen können im Vergleich zu Standard-Säulen unter Erhalt der hohen Trennleistung bei fast 10-facher Fließgeschwindigkeit und trotzdem außerordentlich geringem Rückdruck betrieben werden. 2. Die Entwicklung druckstabiler Sorbentien mit sehr geringen Partikeldurchmessern. Partikuläre Sorbentien mit Partikeldurchmessern von ca. 2 µm weisen eine wesentlich größere Oberfläche, aber auch ein wesentlich geringeres Zwischenteilchen-Volumen als Standard-Säulen auf, das von der mobilen Phase ausgefüllt wird. Dadurch finden auch hier die Massentransfer-Diffusionsprozesse wesentlich schneller als in Standard-Säulen statt. Diese Säulen weisen eine sehr hohe Trennleistung und damit auch eine sehr hohe Peakkapazität auf. Durch Erhöhung der Fließgeschwindigkeit lässt sich die Analysengeschwindigkeit mit diesen Säulen enorm (üblicherweise auf das 10-fache) steigern, allerdings auf Kosten eines sehr hohen Rückdruckes, der die Grenzen von Standard-HPLC-Systemen übersteigt.

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Vorteile der schnellen Chromatographie

Das Schema (Bild 2) zeigt anschaulich die Vor- und Nachteile der schnellen Chromatographie bei Verwendung von Chromolith®-Säulen einerseits und 2-µm-Partikel-Säulen andererseits im Vergleich zu Standard-HPLC-Säulen. Chromolith®-Säulen weisen eine Trennleistung auf, die vergleichbar zu 3...5-µm-Partikel-Säulen ist. Ihre Verwendung auf Standard-HPLC-Systemen ist völlig unproblematisch. Besondere Anforderungen sind nur ein auch für höhere Flussraten geeignetes Gradientensystem und eine schnelle Detektorreaktion wegen der schnell eluierenden schmalen Peaks. Säulen mit Partikeldurchmessern von ca. 2 µm weisen eine ­enorm hohe Trennleistung auf. Bei gleicher Länge können daher wesentlich mehr Peaks getrennt werden. Falls die Peaks gut getrennt sind, kann andererseits die Säulenlänge reduziert werden. Aufgrund der hohen Trennleistung und des geringeren Volumens (auch durch den geringeren Säuleninnendurchmesser z.B. von 2 mm) eluieren die Analyte als äußerst schmale Peaks und bei gleichem Injektionsvolumen mit entsprechend größerer Peakhöhe. Daher kann mit diesen Säulen für die gleiche Probe eine wesentlich höhere Empfindlichkeit erreicht werden. Deswegen ist die Anwendung dieser Säulen für Analysen komplexer Proben z.B. mit LC-MS im biologischen und medizinischen Bereich (z.B. Proteomics, Metabonomics, etc.) äußerst interessant.

Besondere Anforderungen an das HPLC-System

Besondere Anforderungen an das HPLC-System Die Verwendung von diesen sogenannten "ultra"-schnellen Säulen mit 2-µm-Teilchen setzt jedoch besondere Eigenschaften des verwendeten HPLC-Systems voraus: -Erhöhte Druckstabilität des Systems wegen des hohen Rückdruckes der Säulen. -Extrem kleine interne Volumina zur Vermeidung der Peakverbreiterung (Verdünnung) der sehr schmalen Peaks. -Präzise und genaue Lösungsmittel-Gradientenbildung auch bei hohen Rückdrücken. -Extrem geringe Probenverschleppung des Autosamplers wegen der erhöhten Empfindlichkeit (größere Peakhöhe). -Eventuell Anwendung höherer Temperaturen zur Verringerung der Lösungmittel-Viskosität (wegen des hohen Rückdruckes). -Sehr kurze Ansprechzeitkon­stante und sehr hohe Daten­sammel-Rate des Detektors wegen der sehr schmalen schnell eluierenden Peaks.

LaChromUltra™ für die schnelle Chromatographie

Das neue LaChromUltra¿-System von VWR-Hitachi wurde speziell für die Hochgeschwindigkeits-Chromatographie sowohl mit partikulären Säulen als auch mit monolithischen Säulen optimiert und mit speziellen Funktionen ausgestattet. Gleichzeitig ist es auch hervorragend für alle Standard-HPLC-Anwendungen einsetzbar. Mit einer Druckstabilität bis 600 bar steht ein großer Druckbereich für die Anwendung der 2-µm-Partikel-Säulen zur Verfügung. Mit einem Flussbereich bis 5 ml/min lassen sich aber auch schnelle Analysen mit Chromolith®-Säulen durchführen. Das binäre Hochdruckgradienten-System, das mit zusätzlichen Schaltventilen auf bis zu sechs Lösungsmittelkanäle erweitert werden kann, liefert mit Hilfe von vier Drucksensoren und eines speziellen Steuerungssystems Gradienten höchster Präzision. Auf diese Weise werden auch bei hohen Drücken extrem stabile Analyt-Retentionszeiten erhalten. Der Autosampler arbeitet nach dem Direktinjektionsprinzip und injiziert kleinste Volumina mit höchster Präzision und ohne Probenverlust. Durch spezielle Maßnahmen konnte die schon äußerst geringe Probenverschleppung des Vorgängermodells auf die Hälfte reduziert werden. Zwei Peltier-Säulenthermostate verschiedener Säulenkapazität temperieren die Säulen und das Lösungsmittel über einen großen Temperaturbereich mit äußerster Temperaturkonstanz. Die außerordentlich empfindlichen UV-, UV-Vis-, Diodenarray- und Fluoreszenz-Detektoren weisen Ansprechzeit-Kon­stanten bis hinunter zu 10 ms und Datensammelraten bis zu 100 Hz auf, um schmalste, schnell eluierende Peaks genau zu registrieren. Alle interne Volumina des gesamtem Systems wurden minimiert, damit die Qualität der Trennung auf der Säule erhalten bleibt. Das LaChromUltra-System bietet Höchstleistungen nicht nur für Säulen mit kleinen Partikeln, sondern auch für schnelle Analysen mit Chromolith®-Säulen sowie für Standard-HPLC-Anwendungen. Daher können mit dem ­LaChromUltra-System Methodenübertragungen von konventionellen HPLC-Methoden zu schnellen Chromolith®-Methoden sowie zu "ultra"-schnellen Methoden mit partikulären Säulen auf dem selben Instrument durchgeführt werden.

Neue „ultra“- schnelle Säule

Der durch die "ultra"-schnellen Säulen erzeugte Rückdruck ist sehr stark abhängig von der mittleren Partikelgröße und der Partikelgrößenverteilung. Die neue Hitachi LaChromUltra C18-Säule mit 2-µm-Partikeln ist robuster als kommerziell erhältliche Sub-2-µm-Säulen, weist eine nur geringfügig geringere Trennleistung auf und erzeugt dabei einen bedeutend niedrigeren Rückdruck. Damit steht mit dieser Säule ein größerer Flussbereich zur Beschleunigung der Trennungen zur Verfügung. Mit einem flexiblen Säulenanschluss-Kit können alle Säulen an das LaChromUltra -System angeschlossen werden.

Fazit

Mit der Hochgeschwindigkeits-HPLC kann die Analysenzeit bei gleich bleibender Peakauflösung auf etwa 1/10 reduziert werden. Mit anderen Worten: 90 % der Analysenzeit können eingespart werden. Daher bietet sich insbesondere für neue Methoden direkt die Methodenentwicklung mit der "ultra"-schnellen Chromatographie, sei es mit partikulären oder mit monolithischen Säulen, an, wobei auch bei der Methodenentwicklung selbst enorm viel Zeit eingespart werden kann. Bei der Umstellung bestehender Methoden wird man sich zunächst die bisher zeitaufwändigsten Trennungen vornehmen, bei denen das Zeiteinspar-Potential am größten ist. Auf diese Weise lassen sich Probendurchsatz und Produktivität in der HPLC-Analytik um etwa eine Größenordnung steigern. Der eigentliche Engpass verschiebt sich damit zu den immer noch zeitaufwändigen Prozessen der Probenvorbereitung und der Datenauswertung.

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