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FachbeitragHohe Auflösung, schnelle Trennungen

Neue Wege in der HPLC durch POPLC®
Fachbeitrag: Hohe Auflösung,  schnelle Trennungen


S. Lamotte, R. Brindle und K. D. Bischoff*)

  1. Bischoff Analysentechnik und -Geräte GmbH, Leonberg
Die Suche nach der optimalen Trennsäule für eine HPLC-Methode war bisher eine zeitraubende und meist mit „Trial and Error“ verbundene Tätigkeit. Jetzt gibt es die Möglichkeit, sich mit wenigen Messungen auf verschiedenen stationären Phasen die optimale Säule durch eine einfache Software berechnen zu lassen. Hierbei werden sowohl die Selektivität als auch die Auflösung und die gewünschte Analysenzeit berücksichtigt.

Zur Zeit sind über 800 verschiedene Umkehrphasen (RP) für die HPLC erhältlich. Kombiniert man diese Zahl mit den verschiedenen Teilchendurchmessern und Porendurchmessern der einzelnen Materialien und zieht man zudem noch die unterschiedlichen Säulendimensionen ins Kalkül, so erhält man eine Vielzahl an unterschiedlichen Trennsäulen.

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Der Anwender, der nun aus dieser Vielzahl die geeignete Säule für sein Trennproblem finden muss, steht vor einer nahezu unlösbaren Aufgabe. Zwar gibt es Strategien, durch die Auswahl möglichst unterschiedlicher stationärer Phasen die geeignete Trennsäule zu finden, jedoch ist man nie sicher, ob es nicht doch noch eine optimalere Säule für das jeweilige Trennproblem gibt.

Die phasenoptimierte Flüssigkeitschromatographie (POPLC®) hat sich genau dieser Fragestellung angenommen. Bild 1 stellt die Vorgehensweise der POPLC® schematisch dar. Eine Probe oder Einzelsubstanzen werden unter den exakt gleichen isokraten Bedingungen (gleiche mobile Phase, gleiche Fließgeschwindigkeit und gleiche Temperatur) auf einzelne Trennsäulen mit möglichst unterschiedlichen stationären Phasen injiziert. Im POPLC®-Basis-Kit stehen hierzu fünf unterschiedliche stationäre Phasen zur Verfügung:

1. Klassische C18-Phase mit Endcapping: vorwiegend hydrophobe Wechselwirkungen.
2. C18-Phase mit eingebundener polarer Gruppe (Amidphase): neben hydrophoben Wechselwirkungen zusätzliche Wechselwirkungen durch das Elektronenpaar am Stickstoff der Amidgruppe bei Analytmolekülen mit funktioneller Carbonylgruppe. Säuren werden z.B. stärker retardiert als auf herkömmlichen C18-Phasen.
3. Phenyl-Phase: π-π-Wechselwirkungen mit den Analytmolekülen.
4. Cyano-Phase: polare Wechselwirkungen mit den Analytmolekülen.
5. C30-Phase: molekulare Formerkennung von Analytmolekülen. Planare und gewinkelte Moleküle (z.B. cis/trans-Isomere) können voneinander getrennt werden.

Diese fünf stationären Phasen wurden so gewählt, dass ihre Selektivität möglichst unterschiedlich ist und so der große Bereich der RP-Chromatographie nahezu vollständig abgedeckt werden kann. Auch weitere stationäre Phasen wie Ionenaustauscher oder HILIC-Phasen sind als Ergänzung des POPLC®-Kits durchaus denkbar.

Arbeitsweise von POPLC®

Wie bereits erwähnt, werden die Retentionszeiten der einzelnen Komponenten auf den unterschiedlichen Trennsäulen unter isokraten Bedingungen bestimmt und in die POPLC®-Optimizer-Software übertragen. Die Software berechnet nun alle möglichen Kombinationen und Anteile der stationären Phasen und liefert als Ergebnis die beste Phasenkombination für die jeweilige Trennung. Bei den oben beschriebenen fünf stationären Phasen, die für eine 250 mm lange Säule jeweils in 25 Säulensegmente à 10 mm unterteilt werden können, kommt man so auf 142505 Kombinationsmöglichkeiten der fünf stationären Phasen und somit zu 142505 unterschiedlich selektiven Trennsäulen. Für die Berechnung der optimalen Trennsäule werden sowohl die vorgegebene Säulenlänge, Auflösung wie auch die vorgegebene Analysenzeit berücksichtigt. Die von der Software vorgeschlagene Phasenkombination wird nun in Form von Säulensegmenten zusammengesetzt und für die Chromatographie verwendet. Diese segmentierte Trennsäule ist in Bild 2 dargestellt. Mit der so ermittelten Trennsäule kann die Trennung bei Bedarf weiter optimiert werden, z.B. Anpassung der mobilen Phase oder der Temperatur. Sollte es notwendig sein, kann natürlich auch eine Gradientenelution mit der Säule durchgeführt werden.

Beispiel

Durch die Berechnung der idealen Selektivität der Säule gelingt es, hohe Auflösung und schnelle Trennungen mit kurzen Trennsäulen zu erzielen. Dies wird am Beispiel einer Trennung von vier pharmazeutischen Wirkstoffen gezeigt.

Die Basismessungen wurden unter gleichen Bedingungen isokratisch auf kurzen Säulensegmenten durchgeführt. Dabei wurden die einzelnen Standards auf die jeweilige Phase injiziert und die Retentionszeiten bestimmt. Diese Messungen können mit einem Probengeber und einem Säulenwechsler sehr einfach über Nacht durchgeführt werden. Stehen keine Standards zur Verfügung, so müssen die Retentionszeiten anderweitig bestimmt werden. In solchen Fällen setzt man für die Basismessungen auch längere Säulen (jeweils 250 mm) ein, um möglichst hohe Trennleistung zu erzielen. Dies erleichtert die korrekte Bestimmung der einzelnen Retentionszeiten.

Zur Identifizierung der einzelnen Peaks und damit der Retentionszeiten kann z.B LC/MS sehr nützlich sein. Die Retentionszeiten der Basismessungen im Beispiel wurden mit Hilfe von Einzelinjektionen der Standards bestimmt. Die Chromatogramme sind in Bild 3 dargestellt. Es ist klar erkennbar, dass die unterschiedlichen Phasen völlig unterschiedliche Selektivität für die Trennung der vier Analyten aufweisen. Während Pseudoephedrin und Acetaminophen auf C18 und C30 nicht getrennt werden können, zeigen die anderen Phasen für dieses Peakpaar eine gute Trennung, jedoch eluiert auf diesen Säulen Guaiacol zu spät oder die Auflösung zwischen Phenylephedrin und Pseudoephedrin ist zu gering. Die von der POPLC®-Optimizer-Software vorgeschlagene ideale Trennsäule für diese Separation ist eine Kombination aus 120 mm Cyano und 20 mm Phenyl. Die Auflösung für die Trennung des kritischen Peakpaares 1 (Phenylephidrine) und 2 (Pseudoephidrine) liegt bei 3,8 und die Analysenzeit beträgt deutlich weniger als zehn Minuten. Bild 4 zeigt die vorhergesagte und die tatsächlich gemessene Trennung.

Die POPLC® ermöglicht auch robuste und hochauflösende Trennungen in noch kürzerer Analysenzeit. Selbst sehr schnelle Trennungen mit Analysenzeiten unter zwei Minuten wie in der UHPLC sind möglich. Bild 5 zeigt eine solche Trennung unter Verwendung unserer Probe. Eine zusätzliche Verkürzung der Analysenzeit bei dieser Trennung ist durch die Erhöhung der Flussrate einfach möglich.

Fazit

Der Vorteil der POPLC®-Methodenentwicklung liegt in der gezielten, strukturierten, einfachen und schnellen Vorgehensweise. Es sind lediglich fünf Basismessungen notwendig, danach erfolgt die Optimierung mittels der POPLC®-Optimizer-Software am PC. POPLC® ist damit ein ideales Werkzeug zur Entwicklung und Optimierung schneller und robuster HPLC-Methoden.

Literatur

  1. Sz. Nyiredy, K. Dallenbach-Tölke, O. Sticher, Journal of Planar Chromatography, 1 (1988), 1241ff.
  2. Sz. Nyiredy, Z. Szücs, L. Szepesy, Chromatographia, 63 (2006), 3 ff.
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