LABOOBAL LABO April 2010 28 HPLC-TIPP Der Fall Kieselgel ist ein sehr guter Feststoffkata- lysator, es wird vielfach in der chemischen Industrie eingesetzt.
In der RP-Chromato- graphie nun, wo ja Kieselgel die mit Ab- stand wichtigste Matrix darstellt, führt seine Umsetzung mit Silanen aufgrund von sterischen Effekten zu einem Um- setzungsgrad von lediglich rund 50...60 %.
Das bedeutet, dass RP-stationäre Pha- sen eine „nackte“ Kieselgeloberfl äche von immerhin rund 40...50 % aufweisen können.
Die katalytische Wirkung von Kieselgel kann dazu führen, dass manch eine Substanz in der Säule chemisch ver- ändert wird.
Das Ergebnis: Peaks, die im Chromatogramm erscheinen, könnten Substanzen sein, die in der Säule durch die katalytische Wirkung des Kieselgels entstanden sind und nicht ursprünglich in der Probe enthalten waren.
Es liegt auf der Hand, dass diese Gefahr bei län- geren Läufen besteht.
Wie könnte man jetzt überprüfen, ob dies bei einer aktu- ellen Trennung der Fall ist? Die Lösung 1.
Die Probe wird wie gewohnt injiziert, es entsteht ein Chromatogramm.
2.
Die Probe wird erneut injiziert und sobald die Probe sich in der Säule be- fi ndet, wird die Pumpe ausgeschaltet.
Man lässt die Probe ca.
eine Stunde lang in der Säule stehen, schaltet an- schließend die Pumpe wieder ein und vergleicht nun das sich ergebende Chromatogramm mit dem zuerst er- haltenen.
Frage: Bleibt die Anzahl der Peaks konstant oder erscheinen zusätzliche Peaks bei anderen Reten- tionszeiten? Wir haben den Einfl uss der stationären Phase auf die Stabilität von Proben unter- sucht, indem wir unterschiedliche Proben an mehreren Säulen bei veränderten Be- dingungen getestet haben.
Wie erwartet – und auch gehofft – blieb der größere Teil der Proben bei üblichen chromato- graphischen Bedingungen unabhängig vom Füllmaterial stabil.
Andererseits zeigte sich, dass manche Probenbestand- teile an einer Säule stabil waren, an einer anderen Säule jedoch nicht.
Nachfolgend einige Ergebnisse, die diese Effekte er- läutern sollen: In Bild 1 sind die zwei Chromato- gramme aus einem derartigen Experi- ment dargestellt.
Das rote Chromato- gramm ist jenes, das wir nach eben einer Stunde Aufenthalt der Probe in der Säule enthalten haben.
Außer der erwarteten Peakverbreiterung aufgrund der ver- stärkten Diffusion während des länge- ren Aufenthalts der Analyte in der Säule kann nichts weiteres festgestellt werden.
Eine völlig andere Probe bei gänzlich anderen Bedingungen an einer anderen Säule liefert ähnliche Ergebnisse: Ledig- lich Bandenverbreiterung, siehe Bild 2.
Zur Stabilität von Proben in der Säule...
Probe X eine Stunde lang in Säule A ste- hen gelassen.
Probe X eine Stunde lang in Säule B ste- hen gelassen.
Das Experiment bei den chromatogra- phischen Bedingungen wie in Bild 1 wurde wiederholt, allerdings bei Ver- wendung von zwei weiteren Säulen, siehe Bild 3 und Bild 4.
Probe X eine Stunde lang in Säule D ste- hen gelassen.
Merke: Die Peakform der Peaks bei 60,5 min in Bild 3 sowie bei 60,7 min in Bild 4 ist charakteristisch für Zerset- zungsprodukte in der Säule.
Das Fazit Durch das weiter oben beschriebene, einfache Procedere kann überprüft wer- den, ob die Probe oder – genauer – be- stimmte Komponenten der Probe bei den aktuellen chromatographischen Be- dingungen in der Säule in situ durch die katalytische Wirkung des verwendeten Kieselgels chemisch verändert werden.
© by Stavros Kromidas www.kromidas.de Der HPLC-Tipp im April Das kann mit der Probe in der Säule passieren T TIPPPPI ? Von Dr.
Stavros Kromidas, Saarbrücken Bild 4.
Auch hier erscheint bei ca.
60,7 min ein Peak.
Wahrscheinlich handelt es sich um die gleiche Komponente wie in Bild 3, die beim ursprünglichen Chromatogramm an der an- steigenden Flanke des ersten großen Peaks bei ca.
1,2 min zu erkennen ist.
Probe X eine Stunde lang in Säule C stehen gelassen.
3 2 1 4 Bild 3: Die Peaks werden wie zu erwarten breiter, aber mit dieser Säule erscheint zusätzlich bei ca.
60,5 min ein weiterer Peak, der im ursprünglichen Chromatogramm fehlt (der Peak hätte bei ca.
0,5 min erscheinen sollen).
Möglicherweise handelt es sich um ein polares Abspaltungspro- dukt aus dem Komponentenpeak bei ca.
1,2 min.
