LABO April 2011 22 Farbmolekülen, indem sie Komplexe mit ihnen bilden.
Dieser Vorgang wird auch oft modellhaft herangezogen, um zu studieren, wie sich die Bindung und der Transport pharmakologischer Wirkstoffe durch solche polymeren Trägerstoffe be- werkstelligen lassen.
In der vorliegenden Untersuchung wur- den Oligosaccharid-umhüllte Moleküle, deren Kern aus hoch verzweigtem PEI bestand, mit Rose-Bengal-Farbstoff (RB) gemischt.
Aus diesem Ansatz entstand ein als RB@PEI-Mal bezeichneter Komplex [3].
Die Abtrennung nicht-gebundener Farbstoffmoleküle erfolgt üblicherweise durch Methoden wie etwa Dialyse, Ultra- fi ltration oder auch Ultrazentrifugation.
Unglücklicherweise liefern alle diese An- sätze in dem untersuchten System keine quantitativen Daten.
Dies liegt daran, dass die Bindung des Farbstoffes in unter- schiedlichen Bereichen des Moleküls statt- fi nden kann und somit keine zuverlässige Kalibrierung ermöglicht wird.
Aus diesem Grund bedienten wir uns der AF4-Methode, nutzten dabei aber gewissermaßen einen positiven Neben- effekt dieser Technik, der normalerweise eher unbeachtet bleibt: die Ultrafi ltration, welche während der Fokussierungsphase stattfi ndet [6].
Dabei verlässt der nicht gebundene, frei bewegliche Anteil an RB- Farbstoffmolekülen den Trennkanal durch die Membran.
Die deutlich größeren RB@ PEI-Mal-Komplexe verbleiben dagegen im Inneren des Trennkanals, denn für sie ist die Membran nicht permeabel.
Bild 3a zeigt eine schematische Darstellung dieses Vorgangs.
Das Probensystem wurde mittels UV- VIS-Detektion am Querfl ussausgang ka- libriert.
Die Parameter Membranmaterial, Ausschlussgröße der Membran sowie Sta- bilität der gelösten Komponenten RB und RB@PEI-Mal-Komplex wurden untersucht und optimiert, wobei sich eine gute Re- produzierbarkeit ergab.
Die Studien zur Komplexbildung zeigten eine hohe Über- einstimmung der Messwerte mit dem an- zunehmenden Anstieg der Molmasse im Zuge der Bindung des Farbstoffes an den Träger.
In Bild 3b ist diese enge Korrelati- on dargestellt.
Aggregationsverhalten Die Bestimmung der Molmasse dendri- tischer Polymere ist alles andere als ein leichtes Unterfangen, vor allem deshalb, weil man es mit sehr großen Moleküldi- mensionen zu tun hat.
Weitere Probleme bereitet ihre Neigung, Aggregate zu bil- den.
Aufgrund der starken Scherkräfte bei der Säulentrennung liefert bei diesen Molekülen die Anwendung der SEC in den seltensten Fällen verlässliche Ergebnisse.
Das Problem stellt sich bei der AF4-Tren- nung praktisch nicht.
Mehr noch: Mit die- ser Technik lassen sich sogar systematische Studien zur Bildung von Aggregaten un- ter wechselnden Bedingungen wie etwa pH-Wert und Konzentration durchführen.
Ein weiterer Parameter, der die Aggre- gatbildung beeinfl usst, ist natürlich auch der Grad der Verzweigung.
Man spricht in diesem Zusammenhang auch von der so genannten Generationszahl, wobei die Anzahl an funktionellen Gruppen der Dendrimere von der ersten zur dritten Ge- neration hin zunimmt.
Im Folgenden wird die Untersuchung von Lysin-dendronisier- ten MI-Glykopolymeren mit einer Malto- sehülle mithilfe wässriger AF4, gekoppelt an MALLS-Detektion, beschrieben.
Bild 1c zeigt schematisch den Typ von Polymeren, der analysiert wurde.
In diesem Fall wurden Lysin-Dendrone an ein lineares Maleimid-Rückgrat gekoppelt und an- schließend mit einer Oligosaccharid-Hülle modifi ziert.
In Abhängigkeit von der Ver- zweigungszahl, so die theoretische Erwar- tung, sollten sich Unterschiede im Aggre- gationsverhalten der Moleküle zeigen.
Die systematische Untersuchung brachte ans Licht, dass es bei den einfach verzweigten Glykopolymeren der ersten Generation zu keiner nennenswerten Aggregation kam.
Die dritte Generation hingegen aggregier- te bereits bei sehr niedrigen Konzentrati- onen.
Dies ist in Bild 4a zu sehen.
Im nächsten Untersuchungsschritt wur- den hydrodynamischer und Gyrationsradi- us ermittelt und in Beziehung zueinander gesetzt.
Hieraus kann man eine Aussage über die ungefähre Gestalt der Aggregate (sphärisch oder länglich) treffen.
Aufgrund dieser Messungen ließ sich zeigen, dass es sich bei den Aggregaten um stäbchenför- mige Gebilde handelte.
Kombiniert man nun sämtliche im Zuge der AF4-MALLS- Untersuchungen gewonnenen Daten aus den Radius- und Molmassenbestimmun- gen, so erhärtet sich der Befund, wonach man es hier mit lateralen Aggregaten (Bild 4b) zu tun hat [7].
Dieses Ergebnis wurde später mit einer zweiten Untersuchungs- methode bestätigt, und zwar durch die Charakterisierung der Aggregate mithilfe der Rasterkraftmikroskopie.
Zusammenfassung Die asymmetrische Feldfl uss-Fraktionie- rung (AF4) erweist sich als eine überaus geeignete Methode für die schonende Auftrennung von gelösten Molekülen zum Zweck der nachfolgenden Charak- terisierung mittels MALLS-Technologie.
Da bei der AF4 fast keine Scherkräfte auf- treten, kann man sie hervorragend zur Analyse des Aggregationsverhaltens hoch verzweigter Polymere heranziehen.
Überdies kann man sich den Ultrafi lt- rationseffekt der Trennmembran zunutze machen.
Dieser ermöglicht die quantita- tive Bestimmung der Menge an Farbstoff, die von einem PEI-Mal-Polymer gebunden wird.
Die hier geschilderten Eigenschaften der AF4 machen sie auch zu einer vielver- sprechenden analytischen Technologie, wenn es darum geht, neuartige moleku- lare Transportsysteme für pharmakolo- gische Wirkstoffe zu untersuchen.
Referenzen [1] Voit, B.I.
and Lederer, A.
Chem.
Rev.
2009, 109 (11), 5924.
[2] Appelhans, D.
Komber, H.
Quadir, M.A.
Richter, S.
Schwarz, S.
van der Vlist, J.
Aigner, A.
Muller, M.
Loos, K.
Seidel, J.
Arndt, K.F Haag, R.
Voit, B.
Biomacromolecules 2009, 1,0 1114.
[3] Appelhans, D.
Komber, H.
Morgner, N.
Biernert, R.
Thünemann, A.F.
Brutschy, B.
Voit, B.
Polymer Preprints 2008 49, 590.
[4] J.
C.
Giddings, Separation Science and Technology 19, 831, 1984 [5] M.
Erber, S.
Boye, T.
Hartmann, B.I.
Voit, A.
Lederer J.
Polym.
Sci.
Part A: Polym.
Chem.2009, 47, 5158- 5168.
[6] S.
Boye, N.
Polikarpov, D.
Appelhans, A.
Lederer J.
Chromatogr.
A 2010, 1217, 4841–4849.
[7] Burchard, W., and M.
Muller.
1982.
Determination of fi brin structures by light scattering.
In: Fibrino- gen-Recent Biochemical and Medical Aspects.
A.
Henschen, H.
Graeff, and F.
Lottspeich, editors.
Walter de Gruyter Co., New York.
11-45.
Fachbeitrag Bild 4: AF4-MALLS-Messung verschiedener Generationen und b) Strukturbestimmung der Ag- gregate.
Asymmetrische Fluss-Feldfl uss- fraktionierung ?? 311 ? Wyatt Technology Europe, Dernbach, Tel.
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