LABOLABO LABO Mai 2010 16 HPLC-TIPP Der Fall In der Routine werden Anwen- derInnen immer wieder mit folgender Situation konfron- tiert: Die Lebensdauer manch einer Säule lässt zu wünschen übrig.
Und dies, obwohl die Methode validiert und die Robustheit überprüft worden ist.
Der Grund liegt oft darin, dass bei der Überprüfung der Robustheit einer Methode zwar Methodenparameter wie pH-Wert, Eluentenzu- sammensetzung, Säulenchar- ge, Temperatur etc.
im Focus stehen, die Säulenstabilität jedoch nicht als prüfenswert erachtet wird.
Das Ergebnis: Manch´ wunderbar selektive Säule erweist sich ob ihrer ge- ringen Lebensdauer für einen Routineeinsatz einfach als ungeeignet.
Wie kann nun die Säulenstabilität geprüft werden? Die Lösung Man bedient sich eines 3-Stu- fen-Plans: 1.
Die Probe wird wie ge- wohnt bei den üblichen chromatographischen Bedin- gungen injiziert, es entsteht ein Chromatogramm.
2.
Es folgt jetzt ein Säulen- Stresstest unter Anwendung der „10/30%-Regel“.
D.h.
die Säule wird bei etwas „aggres- siveren“ Bedingungen be- wusst gestresst.
Erläuterung: Die Säule wird übers Wochenende bei Bedingungen resp.
Parame- tern gefahren, die je nach- dem ca.
10…30 % höher oder niedriger liegen als bei der Methode eingesetzten.
Und zwar in diese Richtung, die für die Lebensdauer der Säu- le problematisch sein könnte.
Beispiele: Statt einem pH- Wert von 2,5 wird nun ein pH-Wert von ca.
2 eingestellt (im Falle eines alkalischen Eluenten statt beispielsweise dem in der Methode vorge- sehenen pH-Wert von 9 wird jetzt ein pH-Wert von 10 ein- gestellt), statt Start mit 85 % 20 mM Phosphatpuffer beim Eluenten A beginnt man mit einem Gradienten 95 % 30 mM Phosphatpuffer, statt 45 °C nun 55 °C usw.
Nachfol- gend sind Beispiele von zu ändernden Parametern sowie die entsprechende Variation aufgeführt.
Beispiele für „aggressive“ Bedingungen („10/30%-Re- gel“): • Höherer Wasseranteil im Eluenten (z.B.
95…100 %).
• Niedrigerer/höherer pH- Wert (z.B.
pH = 1,5 oder 9,5).
• Höherer Salzgehalt im Elu- enten (z.B.
30…50 (100?) mM).
• Erhöhter Fluss (z.B.
2,5…3,0 ml/min).
• Höhere Temperatur (z.B.
60…80 °C).
Es liegt auf der Hand, dass hier über das Ausmaß der Veränderung nur individuell entschieden werden kann und zudem stark methoden- abhängig ist.
3.
Am Montag früh wird die Trennung bei den üblichen Bedingungen durchgeführt und Retentionszeit, Peakfl ä- che und Peakform (für eine halbquantitative Betrach- tung: Bodenzahl, Tailingfak- tor) mit den Freitagswerten vor der Stressbehandlung verglichen.
Durch das beschriebene Procedere wird eine Alte- rung der Säule von ca.
6 Monaten simuliert.
Ich höre in Seminaren oft folgenden Einwand: „Warum soll ich in Gottes Namen meine teure Säule derart stressen, dass sie dabei eventuell kaputt geht?“ Meine persönliche Meinung dazu: Ich fi nde es sinnvoll, im Fall des Falles bereits am Montag früh erfahren zu müssen, dass die mühsam ausgesuchte Säule zwar eine gute Selektivität zeigt, dass sie allerdings für den Routine- einsatz ungeeignet ist, als dass ich dies erst nach 6 oder 12 Monaten feststellen muss.
Dann ist es nämlich nach be- reits abgeschlossener Validie- rung/Einreichung oder nach erfolgtem Methodentransfer oft zu spät, um noch etwas zu ändern.
Für die KollegInnen in der Pharma: Es ist wohl die Realität, dass in Phase II oft kaum Zeit da ist, um sich noch mit nicht als akut eingestuf- ten Sachen zu beschäftigen und in der Phase III kann man es sowieso „vergessen“...
Das Fazit Man sollte sich vielleicht überlegen, ob für eine für die Routine vorgesehene Me- thode die Überprüfung der Säulenstabilität nicht als ein Bestandteil der Robustheits- Überprüfung aufgenommen werden sollte.
Dazu habe ich mir nach gemachten Er- fahrungen eine klare Mei- nung gebildet: Aus Gründen der Ökonomie wäre dies für mich unabdingbar! Der dafür notwendige Aufwand wäre vertretbar und in diesem Fall stellt er eine goldrichtige In- vestition dar.
Vielleicht zeigt sich, dass manche Alterna- tivsäule mit vergleichbarer Selektivität eine wesentlich bessere Stabilität aufweist.
Ärger, Wiederholmessungen, unnötiger Säulenverschleiß usw.
können unter Umstän- den im späteren Routinebe- trieb so vermieden werden.
© by Stavros Kromidas www.kromidas.de Der HPLC-Tipp im Mai Überprüfung der Säulenstabilität in der RP-HPLC T TIPPPPI ? Von Dr.
Stavros Kromidas, Saarbrücken Roadshow Mikrofl uidik Unter Führung des VDMA Fachverbandes „Micro Technolo- gy“ laden Unternehmen aus dem Bereich der Mikrofl uidik im Raum Mannheim, Frankfurt und Basel sowie in Nordrhein- Westfalen zur Roadshow Mikrofl uidik ein.
Die Tagesveran- staltungen fi nden im Juni statt.
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Die Fachausstellung wird von einem Vortragsprogramm begleitet, das sich vorrangig an Besucher aus den Bereichen Pharma, Feinchemie und Mi- kroreaktionstechnik richtet.
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