LABO August 2011 15 www.labo.de – HPLC-Tipp HPLC-Tipp von Dr.
Stavros Kromidas, Saarbrücken Der HPLC- Tip p im August Die „Kleinen“ im Sommer Auf unserer Website Viele weitere HPLC-Tipps fi nden Sie unter www.labo.de p Labor-Tipps p HPLC-Tipp Der „liebe“ Autosampler… Wir haben an dieser Stelle uns des Öfteren über die Injektion unterhal- ten, aber: Diese Story ist eine unend- liche… Heute möchte ich auf Probleme mit der Reproduzierbarkeit eingehen und auf einige Sachen hinweisen, die man im Alltag vielleicht bedenken soll- te.
1.
Temperatur: Eine häufi ge Praxis ist folgende: Am Anfang einer Serie injiziert man 6 mal einer Standardlösung aus einem Vial.
Wenn die Serie lange dauert, injiziert man womöglich zum Schluss als Bestä- tigung erneut 6 mal.
Oder aber man stellt ein Vial mit der Standardlösung auf Position 1 ins Rack und die gleiche Standardösung wird zum Schluss aus dem letzten Vial im Rack injiziert.
Es sind nun mehrere unangenehme Fälle denkbar: Die Temperatur der Lösung im Vial Nr.
1 ist zu Beginn vielleicht anders als die der gleichen Lösung, die zum Schluss injiziert wird, wenn bei- spielsweise die Proben sich längere Zeit im gekühlten Rack des Autosamplers befanden.
Oder aber es herrscht eine kleine, aber merkliche Temperaturdif- ferenz im Rack, oder aber die Proben von außerhalb haben eine andere Tem- peratur, oder… Wie auch immer, kön- nen Temperaturdifferenzen bei kon- zentrationsempfi ndlichen Detektoren zu Differenzen in der Peakfl äche füh- ren: Entmischung im Vial, Temperatur- und damit Dichtegradient im Selbigen, Verdampfen von Probenlösungsmittel oder umgekehrt Kondensation auf der Unterseite des Septums.
2.
Vakuum: Im Falle von dicht verschlossenen Vials kann bei der Injektion ein Vaku- um entstehen, die Folge könnte eine kleinere als die erwartete/richtige Peakfl äche sein.
Folgender Fall wird nun immer wieder beobachtet: Erste Injektion „daneben“, ab der zweiten Injektion gute Reproduzierbarkeit.
Mögliche Ursache: Nach der ersten In- jektion gelangt durch das nun im Sep- tum entstandene Loch etwas Luft in das Vial, Druckausgleich ist jetzt mög- lich, Reproduzierbarkeit ist gegeben.
3.
Ansauggeschwindigkeit: Wenn viskose Lösungen chromato- graphiert werden sollten (merke: (ge- puffertes) Wasser ist recht viskos!) sind u.U.
sehr kleine Ansauggeschwindig- keiten zu wählen.
Nehmen Sie im Falle des Falles den kleinst möglichen Wert (z.B.
10 ?l/min), es kann gut sein, dass der Vk Ihrer Peakfl äche kleiner wird.
4.
Memory-Effekt: Sollte das Problem beim Autosamp- ler liegen, denken Sie bitte an fol- gende Sachen: • Es könnte sein, dass dieser Analyt an der Stahl-Nadel „hängen“ bleibt, fragen Sie beim Hersteller nach al- ternativen Materialien für die Nadel, z.B.
Messing.
Dieses Problem kann sich dadurch verstärken, dass erstens Kautschuk als Septummaterial ver- wendet wird (ein Krümelchen bietet eine Adsorptionsfl äche).
Oder aber zweitens hat sich die Nadel aufgrund von zu harten Septen oder nach mehrmaligem Treffen auf die Kap- pen bei fehlerhaften Injektion etwas verbogen.
• Tauschen Sie die „Sandwitch-Septen“ gegen die einfachen aus Tefl on.
• Testen Sie, ob es bei Ihrem Autosamp- ler besser ist, vor oder nach der In- jektion die Nadel mit der Purgefl üs- sigkeit zu spülen.
Trivial, deswegen nur kurz erwähnt: Die verwendete Purgefl üssigkeit kann die Injektion beeinfl ussen: Peakform (z.B.
Fron- ting bei „zu“ viel Methanol/ Acetonitril), oder Memory-Ef- fekt (z.B.
mangelnde Lösekraft für apolare Bestandteile bei ei- ner Mischung beispielsweise von 50/50 Methanol/Wasser).
• Sollte Ihr Autosampler mit einer Spritze arbeiten, überprüfen Sie nicht nur optisch, ob dort Verunreini- gungen, Abrieb, eine Luftblase usw.
zu sehen sind, sondern ziehen Sie ab und zu den Stempel manuell hoch: Wenn Sie einen kleinen Widerstand spüren, ist es gut, wenn er auffal- lend leicht hoch und „runter“ geht, stimmt etwas nicht.
• Memoryeffekt evtl.
am Nadelsitz? Kann es sein, dass der Hersteller das Material der Dichtung geändert hat – was übrigens auch zu Geisterpeaks, erhöhten Abrieb etc.
führen kann? • Falls in Ihrem Autosampler ein Rhe- odyneventil verwendet wird: Kann es sein, dass Salze aus Ihrem Puffer Risse/Kanäle in der Rotordichtung hervorgerufen haben und genau dort etwas „hängen“ bleibt, das teil- weise wieder desorbiert wird und neben Problemen mit wechselnden Peakfl ächen auch zu Memory-Effek- ten führt? Generell ist es so, dass viskose Lö- sungen und große Moleküle hier die größten Probleme bereiten – dennoch Kopf hoch und viel Glück! © by Stavros Kromidas www.kromidas.de HPLC-Tden ipps Die schnelle Hilfe fu Èr je Anwender ie- m“ kom- f den vollzieh- or allem hv serlicher gevermittelt,zu-n, Ursa- Theorien rch einen Adressen, en,Tabellttiert.en,nliche .
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