LABO September 2009 14 Geräte mit 20 % Jubiläumsrabatt PRODUKT-INNOVATIONEN 128 ?? Neues PicoQuant-Modul für höchst fl exible FLIM- und FCS-Analysen FLIM-FCS-Modul PicoQuant ?? 74 ? Olympus, Hamburg, Tel.
040/23773-0, Fax 233765, www.olympus.de Ab sofort lassen sich das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop (cLSM) FluoView FV1000 sowie das Multipho- tonen-Laser-Scanning-Mikroskop FV1000MPE von Olympus mit dem PicoQuant-Modul für FLIM und FCS ausstat- ten.
FLIM und FCS sind moderne Methoden zur Messung kleinster Fluoreszenzveränderungen in Zellen.
FLIM wird häufi g für die genaue Bestimmung verschiedenster Faktoren eingesetzt.
Dazu gehören beispielsweise die Analyse der O 2 -, H 2 O- oder Ca2+-Konzentration, der intrazellulären Signaltransduktion und der molekularen Struk- tur und Dynamik.
Zu den FCS-Anwendungen zählen Bestimmungen der molekularen Assoziation/Dissoziation, Konzentration (in Femtolitervolumina), kinetischen Geschwindigkeitskonstanten sowie der intramolekularen Dynamiken in vitro und in vivo.
Das FluoView FV1000 cLSM von Olympus ist dank der FLIM- und FCS-Funktionen jetzt noch vielseitiger und eröffnet Anwendern völlig neue Forschungsmöglichkeiten.
Mit dem neuen PicoQuant-Modul lassen sich modernste FLIM-(Fluores- zenz-Lebensdauer-Mikroskopie-) und FCS-(Fluoreszenz-Korrelations-Spektros- kopie-)Verfahren durchführen.
Es basiert auf zeitkorrelierter Einzel-Photonenzäh- lung (TCSPC – Time Correlated Single Photon Counting) und verwendet die sogenannte Time-Tagged Time-Resolved (TTTR) Datenverarbeitung.
Diese gilt als die präziseste Technik mit der höchsten zeitlichen Aufl ösung.
Gepulste Dioden- laser von 375…900 nm mit regulierbarer Leistung erzeugen die nötigen Pikose- kunden- oder Femtosekundenpulse.
Die Mehrkanalversion kann ebenso eine ge- pulst-alternierende Anregung (Pulsed In- terleaved Excitation oder PIE) ausführen.
Dabei lassen sich bis zu vier gepulste La- ser in einen einzigen Lichtleiter koppeln, so dass die Wechsel zwischen Wellenlän- gen oder simultane Laseranregungen ganz einfach vorzunehmen sind.
Die TCSPC-Datenerfassungseinheit hat eine sehr hohe zeitliche Aufl ösung von 4 ps.
Aufgenommen werden die Daten über einen einzigartigen TTTR- Modus, der zu jedem detektierten Pho- ton die zeitlichen Informationen spei- chert.
Dadurch sind selbst offl ine sehr aufwendige Analysen möglich.
Zwei verschiedene Detektortechnologien – jeweils als Ein- oder Zweikanalsystem verfügbar – sorgen für eine größere Fle- xibilität.
PMTs eignen sich hervorragend für FLIM-Methoden, während spezielle Single-Photon Avalanche Diodes (SPADs) aufgrund ihrer höheren Detektionseffi - zienz ideal für FCS-Anwendungen sind.
Darüber hinaus gibt es für Messungen, die eine hohe Detektionseffi zienz ver- langen, zwei verschiedene SPAD-Typen.
Aufgrund dieser Detektoren besitzt das System die nötige Vielseitigkeit, um Flu- oreszenz-Lebensdauern von weit unter 100 ps aufzulösen und – je nach Aufbau – FLIM-Experimente online auszuführen.
Sämtliche Komponenten der Pico- Quant-Module werden mit der SymPho- Time-Software gesteuert.
Das anwen- derfreundliche Programm verfügt zur Erfassung, Verarbeitung und Analyse der Daten über leistungsstarke Prozesse, wel- che für die Maximierung der FCS- oder FLIM-Techniken erforderlich sind.
Die Software unterstützt zudem etliche ähn- liche Verfahren einschließlich Fluores- zenz-Lebensdauer-Korrelations-Spekt- roskopie (FLCS – Fluorescence Lifetime Correlation Spectroscopy), Fluoreszenz- (oder Förster-)Resonanz-Energie-Transfer (Fluorescence Resonance Energy Transfer oder FRET) und PIE-FRET.
FLIM In der Fluoreszenzmikroskopie wird die Fluoreszenzintensität durch ein Falschfarbenbild dargestellt, während es beim FLIM die Fluoreszenz-Lebens- dauer ist.
Messungen können mit nur einem Detektor vorgenommen werden und sind von Fluktuationen in der Fluo- reszenzintensität, verschiedenen Fluoro- phorkonzentrationen oder der Proben- dicke unbeeinträchtigt.
Dadurch lassen sich oft tiefere strukturelle Erkenntnisse gewinnen.
FLIM ermöglicht es, zwischen Fluorophoren mit ähnlichen Emissions- spektren wie beispielsweise GFP und YFP zu unterscheiden als auch spezifi sche Si- gnale von Autofl uoreszenz zu trennen.
Darüber hinaus ist eine erfolgreiche Kombination mit Fluoreszenz-Resonanz- Energie-Transfer (FRET) möglich.
FLIM eignet sich folglich zur Bestimmung von: Sauerstoff-, Wasser- oder Ca2+-Konzent- rationen, pH-Werten, Abständen im nm- Bereich, intrazellulären Signaltransdukti- onen sowie molekularen Strukturen und Dynamiken und weiteren Faktoren.
FCS Mit der FCS lassen sich auf der Einzel- molekülebene molekulare Eigenschaften sowie Diffusionskonstanten und Kon- zentrationen in Lösungen messen.
Es ist eine überaus präzise und vielseitige Me- thode, die ihr großes Potenzial bereits bei vielen verschiedenen Anwendungen bewiesen hat.
Darüber hinaus kann sie für Lumineszenzsignale verwendet wer- den.
Die Methode beruht auf Schwan- kungen in der Fluoreszenzintensität, verursacht durch einzelne Fluorophore im Anregungsvolumen, welche im zeit- lichen Verlauf aufgezeichnet werden.
Die Intensitätsschwankungen lassen sich hinsichtlich ihrer Stärke und Dauer mittels zeitlicher Autokorrelation der aufgenommenen Signalstärken quanti- fi zieren.
