Fachbeitrag Materialien und Methoden Zur Steigerung der Nachweisempfi ndlich- keit der Analyse von Benzodiazepinen ist eine Hydrolyse erforderlich.
Zur Hydroly- se von Glucuronid-Konjugaten werden ß-Glucuronidase, Urin und Wasser in ein 1,5 ml-Plastikeinweggefäß pipettiert und für 30 min bei 45 °C im Thermoschütttler hydrolysiert.
Nach Zugabe einer Pufferlö- sung, die den internen Standard (IS, c = 2 mg/l) enthält, wird die Mischung kurz maschinell geschüttelt und anschließend für 30 s bei 13,000 x g zentrifugiert.
Das geschlossene Plastikgefäß wird in den Autosampler des TOX.I.S.
gestellt.
Das TOX.I.S.
besteht aus einem binären Pumpensystem (LC-20AT und LC-20AB) mit jeweils einem Lösungsmitteldegasser (DGU-20A5), einem integrierten System Controller (CBM-20AL), einem Autosamp- ler (SIL-20AC), einem Säulenofen (CTO-20 AC) und einem UV-Detektor (SPD-M20A).
Zur Steuerung der Online-Extraktion und der Analytik sind mehrere Schaltventile in die Anlage integriert: ein FCV-20AH2, zwei FCV-14AH und zwei FCV-12AH (alles Shimadzu, Bild 1).
Für die Online-Extraktion wird eine Ex- traktionssäule vom Typ Strata-X (Pheno- menex) verwendet.
Die Probe wird mittels eines Beladungspuffers (pH = 9,0) auf die Extraktionssäule aufgebracht.
Zur chro- matographischen Trennung der Substan- zen dient eine analytische Säule vom Typ C18 Gemini-NX, (150 x 4,6 mm, 3 ?m), der eine Vorsäule gleichen Typs (C18, 4 x 3,0 mm, 3 ?m, beides Phenomenex) vorge- schaltet ist.
Die mobile Phase setzt sich aus Acetonitril/Wasser (90/10, v/v) und einem Kaliumdihydrogenphosphatpuffer (pH 2,3) zusammen.
Die Ofentemperatur be- trägt 40 °C.
Die Detektion erfolgt mittels Diodenarray-Detektor im Wellenlängen- bereich von 195...380 nm.
Das Chroma- togramm wird bei einer Wellenlänge von 230 nm dargestellt.
Die Gesamtzeit der Analyse inkl.
Online-Extraktion beträgt 50 min.
Die Identifi kation der Substanzen er- folgt über die Übereinstimmung der rela- tiven Retentionszeiten (RRT +/- 5 %) sowie über den Vergleich des Absorptionsspekt- rums (Similarität: 0,999 Steuerungs- und Auswertesoftware: LC Solution, Fa.
Shimadzu).
Zur Funktionsprüfung des Systems wird ein Check Mix injiziert.
Mit diesem Check Mix werden die Retentionszeit/relative Retentionszeit, die Peakfl ächen und die Übereinstimmung der Spektren (Similari- tät) mit den Bibliothekseinträgen geprüft.
Die Systemkontrolle ergibt das in Bild 2 gezeigte, typische Chromatogramm.
Um die Leistungsfähigkeit des Systems zu prüfen, wurde die Methode an zahl- reichen Proben im Rahmen der klinisch- toxikologischen Analyse getestet.
Anhand eines (hydrolysierten) drogenfreien Urins (Leerurin) sollte zunächst die Reinheit des Chromatogramms nach erfolgter Online- Extraktion demonstriert werden.
Bild 3 zeigt einen drogenfreien Urin (Leerurin) nach Hydrolyse und automatischer On- line-Extraktion.
Fallbeispiel Eine 44-jährige Frau wurde leblos und stark unterkühlt vorgefunden.
Die Frau wurde reanimiert, intubiert und beatmet.
Da der Verdacht auf einen Suizidversuch mit Medikamenten bestand, wurde eine Urinprobe an das Institut für Toxikologie zur toxikologischen Untersuchung ge- schickt.
Das immunologische Screening der Urinprobe ergab einen positiven Befund auf Benzodiazepine (CEDIA DAU®): cut- off 0,200 mg/l, Referenzsubstanz: Nitraze- pam).
Für eine chromatographische Bestä- tigungsanalyse wurde der Urin zunächst enzymatisch hydrolysiert und nach Zuga- be des internen Standards mittels TOX.I.S.
analysiert.
In dem hydrolysierten Urin wurde Lo- razepam (Peak 10, Bild 4) eindeutig nach- gewiesen.
Lorazepam, ein 3-Hydroxyben- zodiazepin, wird fast ausschließlich als Lorazepam-Glucuronid ausgeschieden [5].
Daher ist es zwingend notwendig, diese Verbindung durch z.B.
enzymatische Spal- tung in das weniger hydrophile Loraze- pam zu überführen und damit der Online- Extraktion besser zugänglich zu machen.
Lorazepam wird u.a.
unter dem Han- delsnamen Tavor® (Hersteller: Wyeth) sowie von verschiedenen Generika-Her- stellern vertrieben.
Im Jahr 2005 wurden in Deutschland über 1 Millionen Packun- gen Tavor verordnet und stand damit auf Platz 4 der meistverordneten Psychophar- maka [12].
Bei einer Überdosierung kann es u.a.
zu Benommenheit, Somnolenz, Ataxie und Blutdruckabfall kommen bei schweren Vergiftungen treten Bewusstlo- sigkeit Atem- und Kreislaufdepressionen hinzu.
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Die Peaks zwischen 6 und 12 min sind Schaltimpulse, entstanden durch das Umschalten der Ventile.
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