LABOLABO HPLC-TIPP Der Fall: Seit Einführung der UPLC von Waters im Jahre 2004 haben mehrere Anbieter nachgezogen, und in der Zwischenzeit wird eine ganze Reihe von UHPLC-, Fast- LC-, RRLC-, usw.-Systeme angeboten.
Diese Geräte machen zurzeit ca.
10 % der Neukäufe aus.
Die Erfahrungen sind durchaus positiv, man sollte sich jedoch einige Fakten bewusst machen.
Die Lösung: Manchmal werden U(H)PLC-Geräte ledig- lich zur Verkürzung der Analysenzeit von alten Methoden benutzt.
Beispielsweise wird aus einem alten 20...30-min-Lauf mit 5...10 Peaks mithilfe der U(H)PLC ein 5...8- min-Lauf.
Wenn dies in etwa das avisierte Ziel war und man damit zufrieden ist, ist alles okay, der Methodentransfer HPLC- U(H)PLC sollte funktionieren, und im Alltag dürfte es hier keine größeren Pro- bleme geben.
Ich wende mich hier eher an KollegInnen, die tatsächlich U(H)PLC betreiben bzw.
betreiben werden: 20...50 mm x 2,1 mm Säulen, 1,7...1,9-?m-Teil- chen, ca.
800...1000 bar, Trennungen un- ter 3...5 min.
In diesem Fall sollte man unbedingt den – mittlerweile offen aus- gesprochenen und konkreten – Emp- fehlungen der Anbieter folgen.
Sonst werden die Möglichkeiten der Geräte nicht genutzt, jene bekommen ungerech- terweise schlechte Noten und man/frau selbst ist recht unzufrieden, mitunter auch frustriert.
Dazu einige Beispiele: • Ab ca.
800 bar aufwärts und kurzen Säulen sollte der Temperaturgradient in der Säule nicht vernachlässigt werden („heat of friction“)! Manchmal ergibt sich eine bessere Peakform, wenn bei tieferen Temperaturen, z.B.
15 °C, ge- messen wird.
• Gradient-grade-Qualität von Lösungs- mittel reicht nicht aus es empfi ehlt sich ein zusätzliches Filtrieren über 2-?m-Fil- ter.
• Trivial, dennoch immer wieder erwäh- nenswert: Will man die gewohnte Le- bensdauer der Säulen erhalten, ist bei schwierigen Matrices eine sehr gründ- liche Probenvorbereitung das „A“ und „O“ ferner sollte der Dichtungsabrieb im Auge behalten werden.
Hier zwei Beispiele: Fall 1: Es wurde in einer UPLC-Anlage ein- mal die vorhandene Kapillare als „norma- les“ Verbindungsstück und einmal eine Wärmeaustauschkapillare, ca.
20 cm, 0,10 mm ID zwischen einer 50 x 4,6 mm, 3-?m- Säule und dem Detektor (PDA) verwen- det.
Durch das etwas größere Volumen der Wärmeaustauschkapillare ergab sich ein nur minimal größerer Tailingfaktor, siehe Bild 1, rechts: Statt ca.
1,28 nun ca.
1,30...1,31.
Anschließend wurden sowohl das Verbindungsstück als auch die Kapilla- re „andersherum“ angeschlossen und die sich ergebenden Tailingfaktoren durch Doppelbestimmung verglichen, s.
Bild 1, links: Während der Tailingfaktor im Falle des Verbindungsstückes praktisch gleich geblieben ist (ca.
1,26...1,28), erhöhte sich im Falle der Kapillare der Tailingfaktor von ca.
1,3...1,31 auf ca.
1,38...1,40.
Er- gebnis: Auch bei einem konstant geblie- benen Volumen einer Kapillare kann ein etwas „schlechterer“ Anschluss an einem Ende der Kapillare die Peaksymmetrie be- einträchtigen.
Ein derartiger Effekt ist bei den üblichen längeren HPLC-Säulen und längeren Retentionszeiten kaum feststell- bar.
Fall 2: Der Tailingfaktor wurde bei vier Temperaturen (30, 40, 50 und 60 °C) und einem konstanten Fluss von 0,7 ml/min bestimmt, s.
Tab.
1.
Ergebnis: Eine schnel- le Kinetik aufgrund einer Erhöhung der Temperatur von 30 auf 60 °C und der da- mit verbundenen Erhöhung der Boden- zahl kann die Verschlechterung der Peak- form/Peaksymmetrie im Falle von sehr frühen Peaks nicht ausgleichen.
Trotz der Verwendung von U(H)PLC-Geräten sollte man sich genau überlegen, wie „schnell“ schnelle Trennungen sein sollten.
Das Fazit: Sollen U(H)PLC-Geräte an den Grenzen der Spezifi kationen genutzt werden, muss man ziemlich umdenken, sonst bleibt manches wie Lebensdauer der Säu- len, Peaksymmetrie, Ausfallzeiten wg.
Suchen von Problemen usw.
hinter den Erwartungen zurück.
Oder aber man ist bereit, bescheidener zu werden...
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Der HPLC-Tipp im Oktober Wenn „U(H)PLC“ als U(H)PLC genutzt werden soll… Bild 1: Tailingfaktor – abhängig von der Rich- tung der eingebauten Kapillare.
Details s.
Text.
Tabelle 1: Fluss (ml/ min) Tempe- ratur (°C) Retenti- onszeit (min) Tailing (interner Faktor) 0,7 60 0,57 595 0,7 50 0,64 330 0,7 40 0,73 280 0,7 30 0,85 250
