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HPLC-TippDas kann mit der Probe in der Säule passieren

Der Fall:
Kieselgel ist ein sehr guter Feststoffkatalysator, es wird vielfach in der chemischen Industrie eingesetzt. In der RP-Chromatographie nun, wo ja Kieselgel die mit Abstand wichtigste Matrix darstellt, führt seine Umsetzung mit Silanen aufgrund von sterischen Effekten zu einem Umsetzungsgrad von lediglich rund 50...60 %. Das bedeutet, dass RP-stationäre Phasen eine „nackte“ Kieselgeloberfläche von immerhin rund 40...50 % aufweisen können. Die katalytische Wirkung von Kieselgel kann dazu führen, dass manch eine Substanz in der Säule chemisch verändert wird. Das Ergebnis: Peaks, die im Chromatogramm erscheinen, könnten Substanzen sein, die in der Säule durch die katalytische Wirkung des Kieselgels entstanden sind und nicht ursprünglich in der Probe enthalten waren. Es liegt auf der Hand, dass diese Gefahr bei längeren Läufen besteht. Wie könnte man jetzt überprüfen, ob dies bei einer aktuellen Trennung der Fall ist?

Die Lösung
1. Die Probe wird wie gewohnt injiziert, es entsteht ein Chromatogramm.

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HPLC-Tipp: Das kann mit der Probe in der Säule passieren

2. Die Probe wird erneut injiziert und sobald die Probe sich in der Säule befindet, wird die Pumpe ausgeschaltet. Man lässt die Probe ca. eine Stunde lang in der Säule stehen, schaltet anschließend die Pumpe wieder ein und vergleicht nun das sich ergebende Chromatogramm mit dem zuerst erhaltenen. Frage: Bleibt die Anzahl der Peaks konstant oder erscheinen zusätzliche Peaks bei anderen Retentionszeiten?

Wir haben den Einfluss der stationären Phase auf die Stabilität von Proben untersucht, indem wir unterschiedliche Proben an mehreren Säulen bei veränderten Bedingungen getestet haben. Wie erwartet – und auch gehofft – blieb der größere Teil der Proben bei üblichen chromatographischen Bedingungen unabhängig vom Füllmaterial stabil. Andererseits zeigte sich, dass manche Probenbestandteile an einer Säule stabil waren, an einer anderen Säule jedoch nicht. Nachfolgend einige Ergebnisse, die diese Effekte erläutern sollen:

In Bild 1 sind die zwei Chromatogramme aus einem derartigen Experiment dargestellt. Das rote Chromatogramm ist jenes, das wir nach eben einer Stunde Aufenthalt der Probe in der Säule enthalten haben. Außer der erwarteten Peakverbreiterung aufgrund der verstärkten Diffusion während des längeren Aufenthalts der Analyte in der Säule kann nichts weiteres festgestellt werden. Eine völlig andere Probe bei gänzlich anderen Bedingungen an einer anderen Säule liefert ähnliche Ergebnisse: Lediglich Bandenverbreiterung, siehe Bild 2.

Zur Stabilität von Proben in der Säule... Probe X eine Stunde lang in Säule A stehen gelassen. Probe X eine Stunde lang in Säule B stehen gelassen.

Das Experiment bei den chromatographischen Bedingungen wie in Bild 1 wurde wiederholt, allerdings bei Verwendung von zwei weiteren Säulen, siehe Bild 3 und Bild 4.
Probe X eine Stunde lang in Säule D stehen gelassen.

Merke: Die Peakform der Peaks bei 60,5 min in Bild 3 sowie bei 60,7 min in Bild 4 ist charakteristisch für Zersetzungsprodukte in der Säule.


Das Fazit
Durch das weiter oben beschriebene, einfache Procedere kann überprüft werden, ob die Probe oder – genauer – bestimmte Komponenten der Probe bei den aktuellen chromatographischen Bedingungen in der Säule in situ durch die katalytische Wirkung des verwendeten Kieselgels chemisch verändert werden.

© by Stavros Kromidas
www.kromidas.de Probe X eine Stunde lang in Säule C stehen gelassen.

Bild 3: Die Peaks werden wie zu erwarten breiter, aber mit dieser Säule erscheint zusätzlich bei ca. 60,5 min ein weiterer Peak, der im ursprünglichen Chromatogramm fehlt (der Peak hätte bei ca. 0,5 min erscheinen sollen). Möglicherweise handelt es sich um ein polares Abspaltungsprodukt aus dem Komponentenpeak bei ca. 1,2 min.

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