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HPLC-TippDer HPLC-Tipp

Die Retentionszeit bleibt konstant – ist somit auch der Fluss automatisch okay?


Der Fall
Sie stellen fest, dass bei WiederhoIinjektionen einer Probe die Retentionszeit konstant bleibt. Bedeutet dies, dass alle Faktoren, die die Retentionszeit beeinflussen können, also – neben Temperatur, Eluent und stationärer Phase – auch der Fluss, in Ordnung sind?

Die Lösung
Bei den drei Erstgenannten zweifelsohne, beim Fluss nicht unbedingt. Erläuterung: Bekanntlich unterscheiden wir bei einer Pumpe zwischen der Langzeit- und der Kurzzeitkonstanz. Wenn die Retentionszeit bei Wiederholinjektionen konstant bleibt, ist die Langzeitkonstanz der Pumpe (also die Streuung des Flusses im Langzeitbereich) in der Tat okay. Daneben gibt es aber auch die Kurzzeitkonstanz der Pumpe: Konstanz des Flusses im Kurzzeitbereich, d.h. Flusskonstanz in der kurzen Zeit während der Elution eines Peaks. Wenn jene nicht in Ordnung ist, wenn also der Fluss hier instabil ist, ändert sich die Peakfläche, da die Aufenthaltszeit der Analyten in der Detektorzelle unterschiedlich ist und somit länger oder kürzer UV-Licht absorbiert wird. Betrachten wir in Bild 1 ein Beispiel aus dem praktischen Teil eines NOVIA-HPLC-Kurses:

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HPLC-Tipp: Der HPLC-Tipp

In Bild 1a sind die Ergebnisse einer 8-fachen Wiederholinjektion einer Substanz wiedergegeben. Sowohl die Langzeitkonstanz der Pumpe (relative Standardabweichung der Retentionszeiten) als auch deren Kurzzeitkonstanz (relative Standardabweichung der Peakflächen) sind mit VK = ca. 0,11 % bzw. VK = ca. 0,17 % hervorragend. Es ist jedoch auch folgendes möglich (siehe dazu Bild 1b): Die Langzeitkonstanz der Pumpe mag okay sein, deren Kurzzeitkonstanz allerdings lässt mit einem VK von ca. 2,67 % zu wünschen übrig. Würden wir in einem solchen Fall uns nur auf die Konstanz von Retentionszeiten verlassen, würden wir bei einer eventuellen Änderung der Peakfläche auf eine unterschiedliche Konzentration der Probe oder bestenfalls auf eine fehlerhafte Injektion schließen – die Pumpe würden wir nicht ohne weiteres verdächtigen...


Das Fazit
Die Tatsache, dass die Retentionszeit konstant bleibt, heißt nicht automatisch, dass die Pumpe im Kurzzeitbereich konstant arbeitet. Letzteres muss über die Reproduzierbarkeit der Peakflächen geprüft werden, sonst käme man womöglich zu falschen Aussagen, da ja üblicherweise über die Peakfläche ausgewertet wird: Der Gehalt würde falsch angegeben, in Wirklichkeit jedoch wäre die mangelnde Kurzzeitkonstanz der Pumpe die Ursache für eine veränderte Peakfläche. Es sei der Vollständigkeit halber erwähnt, dass in der Streuung der Peakflächen selbstverständlich auch die Streuung der Injektion (Reproduzierbarkeit des Probengebers) enthalten ist. Eine Differenzierung der Beiträge von Pumpe und Probengeber auf die Streuung der Peakfläche ist über eine Normierung möglich. Interessierten Lesern sei auf die ausfühlrichen Erläuterungen von Daniel Stauffer in Stavros Kromidas und Hans-Joachim Kuss (Hrsg.) „Chromatogramme richtig integrieren und bewerten“, Wiley VCH, 2008, bzw. auf das Dokument „Tests zur Überprüfung einer HPLC-Apparatur“ auf www.kromidas.de verwiesen.
© by Stavros Kromidas

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