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HPLC-TippDer HPLC-Tipp

Unterschiede von HPLC- und UPLC/UHPLC-Trennungen

Der Fall
Seit einigen Jahren existieren bereits auf dem Markt Systeme, die Trennungen bei Drücken von bis zu 1000 bar erlauben (z.B. Jasco, Waters, Knauer). Man könnte nun vereinfacht annehmen, es handele sich dabei um „normale“ HPLC-Geräte, die lediglich so konzipiert sind, dass sie eben solche hohe Drücke ermöglichen. Das Ergebnis lautet: Merkliche Reduktion der Analysenzeit und des Lösungsmittelverbrauchs sowie – wegen der kleinen verwendeten Teilchen und der damit verbundenen hohen Bodenzahlen – Verbesserung der Auflösung. Zweifelsohne sind dies aus Anwendersicht die wichtigsten Unterschiede/Vorteile gegenüber klassischen HPLC-Trennungen. Beim Methodentransfer jedoch von HPLC- auf UPLC-Trennungen sollte man auch an manch eine Besonderheit der UPLC denken. Damit meine ich nicht bekannte Tatsachen wie peinliche Vermeidung von apparativen Totvolumina, Einsetzen von sehr reinen Chemikalien, die Verwendung von bestimmten Vials (z.B. Glas von Schott 3.00) oder die „richtige“ Einstellung von Datenaufnahme- und Integrationsparametern usw. Was wäre noch zu beachten?

Die Lösung
In der HPLC gilt generell Folgendes: Während der Trennung herrscht in der Säule ein Druckabfall vom Säulenanfang zum Säulenende. Das bedeutet, wir haben einen abfallenden Druckgradienten und einen ansteigenden Temperaturgradienten in axialer Richtung durch die frei gewordene Wärme, die vom Eluenten durch die Säule transportiert wird. Am Säulenkopf ist die erzeugte Wärme größer als am Säulenausgang, was eine ebenso erhöhte Temperaturdifferenz zwischen den zwei Säulenenden bedeutet, vor allem, wenn die Säule bei niedrigeren Temperaturen als bei ca. 50 °C betrieben wird.

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Halten wir also fest: Es herrscht in Richtung Säulenausgang ein (konvexer) Druck-, Viskositäts- und Dichtegeradient und ein umgekehrter Temperaturgradient. Bei der UPLC nun sind diese Differenzen aufgrund des doch sehr hohen Eingangsdruckes von ca. 1000 bar nicht ohne Einfluss. Was ist das Ergebnis?

  • Durch den Temperaturgradienten vom Säulenkopf zum Säulenende haben wir eine gleichzeitige Abnahme des Retentionsfaktors, d.h. eine zunehmende Abnahme der Retentionszeit von später eluierenden Peaks. Dadurch ändert sich die Auflösung, mal positiv, mal negativ. Wenn beispielsweise im vorderen Teil des Chromatogramms viele polare Komponenten eluieren, wird deren Auflösung womöglich verbessert, andererseits können solche Peaks von nachfolgenden Peaks, die nun schneller nach vorne wandern, schlechter abgetrennt werden.
  • Änderung der Bodenzahl.
  • Änderung der relativen Retention.
  • Änderung der UV-Absorption, da deren Temperaturabhängigkeit von Analyt zu Analyt unterschiedlich sein kann.


Das Fazit
Durch den hohen Druck und den damit weiter oben beschriebenen Effekten in der UPLC kann es zu Folgendem kommen: Beim Methodentransfer einer HPLC-Methode auf die UPLC könnten die Ergebnisse im „hinteren“ Teil des Chromatogramms schlechter übereinstimmen als bei sehr frühen Peaks. Das kann die Peakform, die Retentionszeit, die Auflösung, aber auch die Peakfläche betreffen. Es liegt auf der Hand, dass solche Probleme bei sehr hohen Drücken zu befürchten sind. Wird eine UPLC-Anlage (aber auch UHPLC, Fast LC usw.) jedoch „nur“ bei 400…600 bar betrieben, machen sich die hier besprochenen Phänomene weniger bemerkbar.


© by Stavros Kromidas

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