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Diagnostische Mikroskopsysteme werden zukünftig auch ein Farbmanagement beinhalten

Durchlichtmikroskopie – altbewährte Technik in neuem LichtMikroskopische Farbkalibrierung

Virtuelle Mikroskop-Systeme haben in den letzten Jahren starken Einzug in die Pathologie gefunden. Aktuell sind die Hersteller solcher Systeme mit veränderten Forderungen einer medizintechnischen Zertifizierung und somit auch der Notwendigkeit zur Systemkalibrierung konfrontiert. Als farbauflösende Instrumente werden diagnostische Mikroskopsysteme zukünftig auch ein Farbmanagement in ihrer Einrichtungsprozedur beinhalten.Eine Gruppe des International Color Consortium (ICC) erarbeitet daher seit einigen Monaten die notwendigen Spezifikationen.

FFEI-Farb-Referenzmuster

Im Bereich der Durchlichtmikroskopie hat in den letzten Jahren ein Paradigmenwechsel stattgefunden, der außerhalb der spezialisierten Fachwelt weitgehend unbemerkt blieb: Speziell im Bereich der diagnostischen Pathologie werden mehr und mehr vollautomatisierte Mikroskopsysteme eingesetzt, um Gewebeproben zu digitalisieren. Die Objektträger aus Glas machen den sogenannten virtuellen Objektträgern Platz – riesigen Bilddaten, die Dank moderner Kommunikationswege sofort weltweit verfügbar sind. Telemedizin ist Wirklichkeit geworden – zumindest in der Pathologie.

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Farb-Testmuster – mehr als nur ein Standard
Aktuell entsteht eine nächste Generation solcher Virtueller Mikroskop-Systeme (VMS) unter den Anforderungen internationaler Medizinregularien. Es gilt zu gewährleisten, dass die pathologische Befundung am Monitor zu identischen Ergebnissen führt wie die klassische Auswertung am Mikroskop. Eine hohe Qualität der digitalen Gewebebilder und deren Farbtreue sind daher unerlässlich. Eine Fachgruppe des International Color Consortium (ICC Medical Imaging Working Group – MIWG, http://www.color.org/) beschäftigt sich in diesem Sinne seit einigen Monaten mit der Definition der nötigen Standards und Verfahren zur Farbkalibrierung mikroskopischer Durchlichtsysteme.

Im Medienbereich wird ein Farbmanagement mit Hilfe sogenannter ICC-Farbprofile realisiert. Monitor, Drucker, Scanner und Kameras werden dabei auf ein einheitliches Farbsystem geeicht. Dieses etablierte Verfahren könnte einfach für die diagnostischen Systeme übernommen werden, gäbe es nicht ein paar spezielle Aspekte der Mikroskopie zu berücksichtigen.

Da in ein Farbmanagement alle Einzelkomponenten einbezogen werden müssen, also bei einem Drucker auch die Tinte und das Papier, muss die biologische Färbung der Gewebeproben neben der Beleuchtung und der Sensorcharakteristik in die Kalibrierung einfließen. Doch wer die histologischen Präparations- und Färbetechniken kennt, der weiß, dass gerade die biologischen Färbungen wenig als Kalibrierreferenzen geeignet sind. Neben den Farb-Testmustern aus dem Medienbereich, beispielsweise dem IT8.7-Testmuster, verwenden einige Forschungsgruppen und Hersteller speziell angefertigte Referenz- und Kalibriermuster, die den Anforderungen der mikroskopischen Diagnostik eher gerecht werden. Beispielsweise stellt die FFEI (http://www.ffeilifescience.com), ein englischer Partner für OEM-Produktentwicklung, ein Referenz-Testmuster auf der Basis von Biopolymeren her. Diese Biopolymere sind mit typischen Farbstoffen gefärbt. Sie sind in ihren Farbeigenschaften sehr gut reproduzierbar und stimmen in ihrem spektralen Charakter sehr gut mit tatsächlichen Mikroskoppräparaten überein.

Als angestammter Hersteller aus dem Bereich des Farbmanagements bietet Datacolor ein Lösungspaket mit der Bezeichnung ChromaCal an. Es besteht aus Kalibrier-Objektträger, Messgeräte zur Monitorkalibrierung und der zugehörigen Software (http://scientific.datacolor.com/). Der Kalibrier-Objektträger enthält mehrere Farbfelder, bestehend aus schmalbandigen Interferenzfiltern. Die Matrix der Farbelemente liegt in zwei unterschiedlichen Größen vor und erlaubt somit eine Kalibrierung bei unterschiedlichen mikroskopischen Vergrößerungen.

ChromaCal kann an jedem Standard-Mikroskop verwendet werden. Einzige Voraussetzung ist die Verwendung einer typischen wissenschaftlichen Kamera.

ChromaCal ist die einzige kommerziell verfügbare Lösung und bietet eine standardisierte Methode zur Farbkorrektur/Farbkalibrierung von mikroskopischen Durchlichtbildern.

Farbkalibrierung - in aller Kürze
Es gibt keine Farben – außerhalb unserer Köpfe. Unsere drei Zapfentypen im Auge integrieren Licht kurzer, mittlerer und langer Wellenlängen. Aus diesen Zapfen-signalen entsteht unser Farbeindruck (fachspr.: Farbvalenz). Aufgrund dieses integrierenden Charakters können Lichtsignale (fachspr.: Farbreize) mit unterschiedlicher spektraler Zusammensetzung zu gleichem Farbempfinden führen. Man nennt diesen Effekt Metamerie.

Im Falle der Mikroskopie basieren die Farbreize auf der spektralen Veränderung der Beleuchtung durch die gefärbte Gewebeprobe. Die Kombination von Proben- und Beleuchtungseigenschaften bilden eine multiplikative Einheit. Von beiden Eigenschaften hängt also die Charakteristik des Farbreizes ab, und ob die in der Diagnostik unerwünschte Eigenschaft der Metamerie auftritt.

Betrachtet man die Fähigkeit eines digitalen Mikroskopsystems zur Differenzierung und Reproduktion von Farben, dann müssen auch die Sensor- und die Monitorcharakteristik in diese Einheit aufgenommen werden. Alle vier Komponenten (Beleuchtung, Färbung, Sensor, Monitor) bilden in ihrem Zusammenwirken einen spezifischen Farbraum. Diese geräteabhängige Farbcharakteristik wird bei einer Farbkalibrierung mit Hilfe der Farb-Testmuster ermittelt und in einen geräteunabhängigen kolorimetrischen Farbraum umgerechnet. Internationaler Standard ist hierfür der CIE-XYZ-Farbraum, der auf einer physiologischen Normbeobachtung beruht. Unter Angabe eines Beleuchtungsstandards kann dann jede durch die Gewebeprobe hervorgerufene Farbvalenz im CIE-XYZ-System eindeutig und geräteunabhängig definiert werden.

Bild 5 zeigt die Wirkung einer solchen ICC-Farbkorrektur an einem Hämatoxylin/Eosin-gefärbten Gewebeschnitt. Die visuelle Verbesserung der Eosin-Darstellung ist klar erkennbar.

Biologische Färbung – herausfordernd noch nach 200 Jahren
Die besondere Herausforderung einer reproduzierbaren Farbaufnahme von mikroskopischen Durchlichtpräparaten ist die Färbung selbst, denn gerade sie ist nicht exakt reprozierbar. Färbungen sind diversen Einflüssen unterworfen. Die Ausprägung einer Färbung, also das tatsächliche Absorptionsspektrum eines Färbemittels, ist stark variabel und hängt von Präparation, Vorbehandlungen, Färbedauer, pH-Wert und Nachbehandlung ab.

Viele Färbungen sind in ihrer Wirkung physikalisch-chemisch nicht vollkommen aufgeklärt. Viele sind empirisch entwickelt und werden bei Bedarf angepasst. Einige Gewebe-Farbstoff-Kombinationen zeigen bei bestimmten Färbemethoden eine Änderung des Farbtons – eine sogenannte Metachromasie.

Die Farbkalibrierung eines diagnostischen Mikroskopsystems kann keinen dieser Effekte beseitigen. Im Gegenteil: Die auftretenden Effekte sollen vom System möglichst exakt wiedergeben werden, da sie teilweise wichtige diagnostische Informationen kodieren. Aus diesem Grund ist die Farbkalibrierung für die medizinische Diagnostik von großer Bedeutung, um systemseitige Fehlerquellen zu reduzieren, die Verlässlichkeit des Systems zu erhöhen und zeitliche Drifts der Systemcharakteristik einschätzen zu können.

Ein Farbmanagement von Durchlicht-Mikroskopsystemen trägt zur Verbesserung der visuellen Qualität im Sinne einer Übereinstimmung von Monitorbild und Okularblick bei und stellt eine wichtige Voraussetzung für die digitale Analyse der Messergebnisse dar. Es ist zu erwarten, dass das Thema Farbmanagement für die diagnostische Mikroskopie in naher Zukunft zu einer Selbstverständlichkeit wird, so wie es im professionellen Medienbereich längst der Fall ist. Die nötigen Voraussetzungen und Spezifikationen werden gerade erarbeitet. Die zukünftigen Diskussionen der Medical Image Working Group (MIWG) des ICC werden sicher weitere interessante Informationen bereithalten.

Zusammenfassung
Durchlichtmikroskopie, heute oft im Schatten super-auflösender Techniken, hat sich in einer umwälzenden Entwicklung zu einer hochautomatisierten medizinischen Routinetechnologie gemausert. Virtuelle Mikroskop-Systeme haben im diagnostischen Bereich einen Paradigmenwechsel hin zur Digitalisierung hervorgerufen. Aktuelle Bemühungen zur Optimierung, Kalibrierung und Zertifizierung solcher Mikroskop-Systeme dienen der medizinischen Akkreditierung als diagnostische Systeme. Der hier beleuchtete Aspekt der Farbkalibrierung, der aktuell von einer Gruppe von Wissenschaftlern unter dem Dach des International Color Consortium (ICC) studiert wird, beinhaltet neben geeigneter Verfahren zur Umrechnung von Farbinformationen die Definition eines geeigneten Farb-Kalibrierstandards. Diese Medical Imaging Working Group (MIWG) des ICC arbeitet an einer geeigneten Empfehlung für solche Standards und für eine Implementierung von Farbmanagement-Lösungen. Der interessierte Leser kann in den öffentlich zugänglichen und sehr informativen Berichten der MIWG weitere Details zum Thema finden. (www.color.org/groups/medical/histopathology_calibration_slide.xalter).

Autor:
Peter Haub
Imaging Consultant, 68804 Altlussheim,
E-Mail: phaub@dipsystems.de

Bildnachweis und Quellen
[1] International Color Consortium (http://www.color.org/).

[4] Allan H. Olson; Calibration of Leica Scanscope AT2; ICC Medical Imaging Working Group – 18 Nov 2013; www.color.org/groups/medical/Olson.pdf.

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