Der Qualitäts-Tipp im Dezember

Dr. Astrid Merz, NOVIA GmbH

Die Spektroskopie wird in ihrer ursprünglichen Form zur Strukturaufklärung oder Identifizierung von chemischen Substanzen eingesetzt und scheint daher prädestiniert für einen Identitätsnachweis im Sinne der Qualitätskontrolle zu sein. Für den Einsatz einer spektroskopischen Methode in der Routineanalytik müssen Spektren in hohem Maße reproduzierbar sein (und sind es auch). Hierbei liegt der Schwerpunkt nicht nur auf der exakten Lage einer Bande/eines Signals, sondern vielmehr auf der Reproduzierbarkeit der verschiedenen, charakteristischen „pattern“ der Substanzen. Diese hoch-substanzspezifischen Muster ermöglichen in gewissem Umfang auch eine automatisierte Spektrenauswertung. Die NMR wird zunehmend in der Analytik von Zwischenprodukten, in der pharmazeutischen Arzneistoffanalytik und anderen Bereichen zum Nachweis unterschiedlichster Substanzen eingesetzt. Die Reinheitsbestimmung und Quantifizierung der Proben steht hierbei im Vordergrund.

Grundlage der quantitativen NMR-Messungen ist die Proportionalität der Signalintensität zu der das Resonanzsignal verursachenden Anzahl an Kernen. Die Proportionalitätskonstante, die häufig als Spektrometerkonstante bezeichnet wird, muss innerhalb eines Spektrums konstant sein und ist ein Hinweis auf die Einhaltung der Aufnahmeparameter.

Diese Proportionalität ermöglicht NMR-Messungen mit dem Ziel, Stoffmengenverhältnisse und -anteile zu bestimmen sowie Reinheits- und Gehaltsanalysen durchzuführen. Somit ist die NMR-Spektroskopie als „primäre Messmethode“ im Sinne des Qualitätsmanagements geeignet. Die Messungen können kalibrierfrei und zerstörungsfrei erfolgen – erforderlich hierfür ist natürlich die exakte Einwaage und Zugabe eines internen Standards.

Bei der Validierung von NMR-Methoden muss der Einfluss aller Parameter auf die Genauigkeit des Ergebnisses festgestellt werden. Für ein einfaches Single Pulse-(SP-) Experiment müssen also die Aufnahmeparameter, die Prozessierungsparameter und die Spektrenintegration untersucht werden: Durch die Homogenisierung des Magnetfeldes (engl. shimmen) kann die Auflösung eines Spektrometers optimiert werden. Ein Auflösungstest gemäß Arzneibuch sieht die Messung von 5 % Tetramethylsilan (TMS) in CDCl3 (deuteriertes Trichlormethan) vor. Hierbei muss die Linienbreite von TMS in halber Höhe <0,5 Hz betragen. Für die Kontrolle einer optimalen Peakform eignet sich der Hump-Test.

Ebenso ist sowohl die Aufnahmezeit bei der Detektion des Relaxationsvorgangs FID (engl. free induction decay) relevant als auch die Anzahl der Scans, die zur Datenakkumulation durchgeführt werden. Beachtenswert ist in der NMR-Spektroskopie die variable Nachweisgrenze. Die Nachweisgrenze wird wie üblich durch Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) definiert. Dieses aber hängt wie bei allen akkumulierenden Methoden von der Zahl der akkumulierten Messungen ab. Um eine größtmögliche Vergleichbarkeit unterschiedlicher NMR-Spektren zu gewährleisten, ist auch die Kalibrierung der Chemischen Verschiebung unabdingbar.

Grundlage für eine optimale Integration des Spektrums ist eine nahezu ideale Grundlinie, die eine Auswertung und automatisierte Integration mit geringer Messunsicherheit ermöglicht. Die Reproduzierbarkeit der Integration über den NMR-Signalen muss gegeben sein. Bei fünf Messungen darf das Signal einer Einzelmessung laut Arzneibuch nicht >2,5 % vom Mittelwert aller fünf Integrale abweichen.

Robustheit

Die Untersuchungen zur Robustheit einer NMR-Methode sollten aufgrund der nicht-kontaminierenden und nicht-destruktiven Messung solche Parameter variieren, die einen potentiellen Einfluss auf das Messergebnis haben. Die Robustheit von NMR-Methoden hängt in hohem Maße von der Probe selbst und der Vorbereitung zur Messung ab. Hierbei gilt es die Stabilität der Probensubstanz im Lösungsmittel und die pH-Abhängigkeit zu beachten.

Am Beispiel eines Vorfalls aus dem Jahr 2008 bezüglich Verunreinigungen in unfraktioniertem Heparin wird die zunehmende Bedeutung der NMR-Spektroskopie in der Qualitätskontrolle deutlich: Bei der parenteralen Anwendung bestimmter Heparine kam es aufgrund einer Verunreinigung oder Beimengung zu schwerwiegenden allergischen Reaktionen. Das Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte (BfArM) ordnete daraufhin zwei exakt definierte Analysen an. Methodisch war hierbei eine Kapillarelektrophorese oder NMR-Spektroskopie möglich. Neben allgemeinen Angaben zur Feldstärke des Spektrometers, des zu verwendenden deuterierten Lösemittels und des internen Standards sind in den Vorgaben exakte Angaben bezüglich akzeptabler Abweichungen in Bezug auf die maximale Peak-Verschiebung, die Pulsstärke und -länge sowie das Signal-Rausch-Verhältnis enthalten.

Literatur

Weitere Informationen zum Thema finden Sie in der Neuauflage des Handbuches „Validierung in der Analytik“, Hrsg. Dr. S. Kromidas, Wiley-VCH.

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