Die Chromatographie des Sonnenlichts

Das „Sonnenvitamin“ Vitamin D ist das einzige Vitamin, das vom menschlichen Körper hergestellt wird. Es entsteht, wenn die Haut in Kontakt mit Sonnenlicht kommt. Aber auch Menschen, die in den sonnigsten Regionen leben, produzieren möglicherweise nicht ausreichend Vitamin D.

Vitamin D, siehe Bild 1, bezieht sich auf Vitamin D₃ (Cholecalciferol), die in der Haut durch Einstrahlung von Sonnenlicht produzierte Form, sowie Vitamin D₂ (Ergocalciferol), das durch die Bestrahlung von Pflanzenmaterial mit UV-Licht entsteht und die gängigste Form von Vitamin D darstellt, welches in verschreibungspflichtigen Ergänzungsstoffen zum Einsatz kommt. Natürliche Quellen für Vitamin D₃ umfassen fetthaltigen Fisch (wie Lachs oder Makrele), Lebertran und angereicherte Lebensmittel (wie Milch, Orangensaft, Butter, Käse und Müsli). Verschreibungspflichtige Vitamin-D-Präparate enthalten Vitamin D₂ (50 000 IE/Kapsel), während frei verkäufliche Nahrungsmittelergänzungsstoffe Cholecalciferol (D₃) enthalten (400, 800, 1000 und 2000 IE/Kapsel).

Wenn Patienten spezifisch mit Vitamin D₂ behandelt werden, ist es in hohem Maße wünschenswert, zwischen den beiden Formen des Vitamins unterscheiden zu können, damit die Wirksamkeit der Dosierung bestimmt werden kann. Im Körper wird das Vitamin an ein Transportprotein gebunden, so dass die Probenzvorbereitung in der Lage sein muss, 25(OH)D von seinen Trägerproteinen zu trennen.

Schnelle Säulenseparation

Fortschritte in der Säulentechnologie machen das UHPLC-Verfahren zu einer praktischen und hochzuverlässigen Technik für die spezifische Analyse von Vitamin D₂ und D₃. Neueste Entwicklungen in der Flüssigkeitschromatographie-Säulenpackung nutzen Materialien mit einer Partikelgröße von unter 2 µm. Dies ermöglicht höhere Phasengeschwindigkeiten ohne Beeinträchtigung der Separationseffizienz, wie sie mit Säulen mit größeren Partikeln erreicht wurde.

Diese Säulenmaterialien mit einer Partikelgröße von unter 2 µm werden in der Regel in Säulen mit einem Innendurchmesser von 2,1 mm gepackt. Durch den Einsatz von kleineren Partikeln sind jedoch höhere Betriebsdrücke erforderlich, was wiederum Herausforderungen im Hinblick auf die Auslegung von Pumpen und Injektoren mit sich bringt. Durch technologische Fortschritte können diese Mikropartikelsäulen unter Einsatz von handelsüblichen Systemen wie dem PerkinElmer FX15 LC indessen bei Drücken von bis zu 1250 bar verwendet werden. Die Säulen werden unter hohem Druck gepackt, was eine außerordentlich enge Partikelgrößenverteilung ergibt, die die Säulenstabilität für UHPLC-Anwendungen gewährleistet. Die geringe Partikelgröße und die robuste Auslegung sorgen im Verbund für eine hohe Säulenauflösung und hohe Probendurchsätze.

UHPLC mit MS-Detektion

Während die chromatographische Separation der Proben ein Schlüsselelement der Analyse darstellt, ist eine eindeutige Identifizierung der Probenkomponenten unerlässlich. Die Single-Quadrupol-Massenspektrometrie bietet aufgrund ihrer Schnelligkeit, einfachen Anwendbarkeit und Spezifität ein ausgezeichnetes Detektionsverfahren. Die daraus resultierende kombinierte UHPLC/MS-Technologie eignet sich aufgrund ihrer Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen 25(OH)D2 und 25(OH)D3 ideal für die Vitamin-D-Bestimmung, was insbesondere bei der Überwachung der Vitamin-D-Werte von Patienten von Bedeutung ist, die mit Vitamin D₂ behandelt werden.

Die Akzeptanz von UHPLC/MS in klinischen Testlaboren ist zum Teil auf Entwicklungen bei der Software und im Instrumentenbereich zurückzuführen, die eine nahtlose Integration der chromatographischen Trennung mit den leistungsstarken Erkennungs- und Messfunktionen der Massenspektrometrie ermöglichen. Das Flexar™ SQ 300 MS Single-Quad LC/MS-Detektionssystem von PerkinElmer vereint Schnelligkeit, Empfindlichkeit und Bedienfreundlichkeit und versetzt Labore somit in die Lage, unter Einsatz von vordefinierten Verfahren präzise Ergebnisse mit hohen Probendurchsätzen zu erzielen.
Die mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (Ultraspray) geladenen Moleküle werden in Richtung des Einlasses des Massenspektrometers geleitet, wo die Probe vom Rand des Probennebels genommen wird. Da die Tröpfchen in diesem Bereich kleiner sind, benötigen sie zur Ionisation weniger Energie, so dass auch schwache molekulare Strukturen für die Analyse erhalten bleiben.

Die Flüssig-flüssig-Extraktion (LLE), Festphasenextraktion (SPE) und Proteinfällung (PPT) sind gängige Verfahren für die Probenvorbereitung in biologischen Analysenlaboren. Dabei werden die Proben ausgefällt, um Substanzen mit hohem Molekulargewicht zu entfernen. Anschließend wird die Festphase extrahiert, das Eluat mit Stickstoff verdampft und in einer mobilen Phase suspendiert, um auf die HPLC-Säule injiziert zu werden. Die UHPLC/MS-Technik gestattet eine schnelle Analyse von biologischen Proben, da die erforderlichen Probenvolumina mit in der Regel 50...150 µl sehr gering sind.

Analyse von Vitamin D

Von den Patienten- und Kontrollproben aus humanem Serum wurden 150 µl mit 50 µl internem Standard 25-Hydroxy-Vitamin-D₃-d₆ versetzt und anschließend gemixt. Danach wurden 150 µl 0,2 M ZnSO₄ hinzugefügt und die Probe erneut gemischt. Abschließend wurde die Mischung mit 750 ml Hexan angereichert und 7 min lang mit 8000 min^–1 zentrifugiert. Die oberste Schicht, die organische Phase, wurde entfernt und mit Stickstoff ausgeblasen. Die Probe wurde in 100 µl MeOH/H₂O aufgenommen.

Nach der Probenvorbereitung wurden die Proben mithilfe einer Perkin-Elmer Brownlee™ HRes Analytical DB C18-Säule (2,1 mm x 50 mm, 1,9 µm) analysiert. Die mobile Phase bestand aus A: Wasser mit 2 mM Ammoniumacetat und 0,1 % Ameisensäure sowie B: Methanol mit 2 mM Ammoniumacetat und 0,1 % Ameisensäure. Die Analyse wurde unter isokratischen Bedingungen mit einer Flussrate von 0,3 ml/min durchgeführt.
Der Vorteil dieser UHPLC/MS-Technik zur Bestimmung von Vitamin D ist die Spezifität der Analyse, die eine Unterscheidung zwischen Vitamin D₂ und D₃ gestattet. Dank einer effizienten chromatographischen Separation in Kombination mit der sanften ESI-Ionisationstechnik kann das System zwischen den verschiedenen Formen von Vitamin D unterscheiden. Das Quadrupol-Design sorgt für eine außergewöhnlich schnelle Datenerfassung (10 000 u/s), so dass es sich ideal für die UHPLC-Analyse im simultanen Full Scan-Modus sowie im Selected Ion Monitoring-(SIM-)Modus eignet. Während die Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometern (LC-MS/MS) ein gängiges Verfahren darstellt, ermöglicht das Single-Quadrupol-System mit stoßinduzierter Dissoziation (CID) auch, die erforderliche Spezifität zu erzielen. Bild 2 zeigt, wo die Spannung am Kapillarauslass moduliert wird, um die effektive CID und reproduzierbare Fragmentierung der Probe sicherzustellen. Das Single-Quadrupol-Analysengerät unterzieht die molekularen Fragmente anschließend einer Massenfilterung, so dass Anwender eine spezifische Form des Vitamins bestimmen können.

Kontrollierte Flexibilität

Das Chromera-Datensystem bietet eine gemeinsame Kontrolle der UHPLC- und MS -Parameter und wurde speziell für Chromatographie-Anwendungen entwickelt. Anwender können exakt die Art und Form von Informationen wählen, die sie anzeigen möchten, um einfachere, deutlichere und relevantere Ergebnisse zu erzielen. Das Chromera CDS verfügt zusätzlich über eine automatische Tunefunktion, die mit einem Mausklick das Tunen und die Kalibrierung des Instruments für beide Polaritäten mit maximaler Geschwindigkeit ermöglicht. Das Tunen kann für 3000 Masseeinheiten durchgeführt oder auf einen vom Anwender festgelegten Massebereich beschränkt werden, um bessere Geschwindigkeiten und Ergebnisse zu erzielen.

Bild 3 zeigt die klare Trennung der Peaks der Proben von 25-Hydroxy-Vitamin D₃, 25-Hydroxy-Vitamin D₃<nonbreaking-hyphen>d₆ und 25-Hydroxy-Vitamin D₂, die eine SIM-Überwachung von Vitamin D₂- und D₃-spezifischen Ionen ermöglichen. Die hier für die routinemäßige Vitamin-D-Analyse mit UHPLC/SQ-MS verwendeten Bedingungen ergaben stark symmetrische Peaks mit einer Zykluszeit von 6 min, was die Schnelligkeit des UHPLC/MS-Verfahrens im Vergleich zu anderen Techniken eindrucksvoll unterstreicht. Die Detektionsempfindlichkeit wird durch die Einfachheit und Schnelligkeit der Analyse nicht beeinträchtigt. Patientenproben in Mengen von weniger als 4 ng/ml 25-Hydroxy-Vitamin D konnten zuverlässig erkannt und quantifiziert werden. Gemäß aktuellen Standarddefinitionen gelten Werte von <6 ng/ml als erheblicher Vitamin-D-Mangel, <16 ng/ml als Mangel, <20 ng/ml als leichter Mangel und Werte von >20 ng/ml als normal. Die UHPLC/MS-Technik bietet somit ein zuverlässiges Verfahren für die Erkennung und Quantifizierung von Vitamin-D-Werten im klinisch signifikanten Bereich.

Schlussfolgerungen

Die Vorteile der Chromatographie bei der Separation von sehr ähnlichen Komponenten in komplexen Mischungen sind seit langem bekannt, so dass die Technik weithin für die Bestimmung des Vitamin-D-Gehalts in humanem Serum eingesetzt wird. Die Kombination aus verbessertem Säulendesign, schnellen chromatographischen Separationen (UHPLC) mit robusten Single-Quadrupol-Massenspektrometrie-Detektoren (MS) und komplexen Datensystemen verschafft UHPLC/MS-Systemen einen festen Platz in heutigen Bioanalyse-Laboren.

Sean Daugherty*)

1. LCMS-Applikationsspezialist, PerkinElmer Inc.