Effiziente, schnelle Bestimmung von Ochratoxin A mit HLPC-FLD

Schimmelpilz in Bier?

Die Verunreinigung von Nahrungsmitteln mit Mykotoxinen ist aufgrund anerkannter Gesundheitsgefahren zunehmend auf dem Radar der  Lebensmittelüberwachung. Neben den zulässigen Höchstgehalten von reglementierten und neuen Mykotoxinen in Lebensmitteln wird auch über die Untersuchung weiterer Matrices in der Wissenschaft und bei den Behörden diskutiert. Vor diesem Hintergrund ist die Entwicklung leistungsstarker und effektiver Analysenmethoden notwendig, um eine zuverlässige Kontrolle belasteter Lebens- und Genussmittel zu gewährleisten.

Schimmelpilz in Bier?

Ochratoxin A (OTA) ist ein nephrotoxisches (nierenschädigendes), immunotoxisches (das Immunsystem schädigendes) und karzinogenes (krebserregendes) Mykotoxin, welches durch verschiedene Schimmelpilzspezies der Gattungen Aspergillus und Penicillium produziert wird. Die Hauptquellen von OTA in der Nahrung sind Zerealien wie Roggen, Gerste, Weizen und Mais. Folglich kann OTA auch in Getränken wie z.B. Bier nachgewiesen werden.

Um Ochratoxin A zu bestimmen, ist die Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (HPLC) in Verbindung mit einem Fluoreszenz-Detektor (FLD) eine oft verwendete Methode, die auch in der Europäischen Norm EN 14133 (2009) beschrieben wird. Obwohl die Rohstoffe schon auf ihren Gehalt an Mykotoxinen untersucht werden müssen, berichten verschiedene Studien unabhängig voneinander über die Belastung von Bieren mit OTA. Aufgrund des durchschnittlichen Pro-Kopf-Verbrauchs von etwa 100 Litern pro Jahr ist eine regelmäßige Rückstandsanalytik sinnvoll, auch wenn aktuell noch über einen Höchstgehalt für OTA in Bier auf EU-Ebene diskutiert wird.

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Probenaufreinigung mittels Ionen-Affinitätssäulen und Festphasenextraktion
Gewöhnlich ist eine selektive Probenaufreinigung notwendig, da mit einer hohen Interferenz bei der Analytik durch die Lebensmittelmatrix zu rechnen ist. Für die Aufreinigung von Bierextrakten haben sich u.a. Ionen-Affinität oder Festphasenextraktion (SPE) etabliert.

In der hier vorgestellten Studie wird das Potenzial eines einfachen Arbeitsablaufs zur Bestimmung von Ochratoxin A in Bier durch eine schnelle Probenvorbereitung und hochsensitive Quantifizierung mittels HPLC und Fluoreszenz-Detektion in weniger als 25 min gezeigt. Hierzu wurde eine Bierprobe (Markenbier, MHD 25.01.2015) als Testmatrix ausgewählt. Etwa 200 ml Bier wurden dazu für 5 min in einem Ultraschallbad entgast. Die Probenaufreinigung erfolgte über zwei unterschiedliche Methoden, die im Folgenden beschrieben werden.

Zunächst wurde eine MycoSpin-400-Aufreinigungssäule (Coring Systems Diagnostix GmbH, Gernsheim, Deutschland) verwendet. 25 ml Bier wurden mit 100 ml einer Mischung aus Acetonitril und Wasser (1:1) für 10 min in einem Ultraschallbad extrahiert. Anschließend wurden 500 µl Essigsäure (w = 100 %) zu 10 ml des Extrakts gegeben und 1 ml dieser Lösung mit der Spin-Säule aufgereinigt. Nach Zentrifugation für 30 s bei 10 000 min-1 wurden 250 µl des Extrakts mit 250 µl einer 0,1%igen Ammoniumformiat-Lösung verdünnt.

Für die zweite Methode wurde eine Ionen-Affinitätssäule otaClean SMART (LCTech, Dorfen, Deutschland) verwendet. Hierbei wurden 8 ml einer 3%igen NaHCO3-Lösung zu 20 ml Bier gegeben. 10 ml des Extrakts wurden mit 40 ml Phosphatpuffer (pH 7,2) versetzt und mit der Ionen-Affinitätssäule aufgereinigt. Zunächst wurde die Säule mit 2 ml Wasser gewaschen, bevor diese mit 400 µl Methanol eluiert wurde. Der letzte Schritt umfasste die Verdünnung von 100 µl des Extrakts mit 100 µl Wasser.

Bild 1: Kalibrationskurve von OTA in Biermatrix. R2 = 0,9999. LOQ: 0,3 ng/ml, LOD: <0,1 ng/ml.

Die Proben wurden jeweils vor und nach der Extraktion mit 10 ng OTA dotiert. Die vor der Extraktion mit OTA versetzten Proben wurden verwendet, um die Wiederfindung zu beurteilen; mit den nach der Extraktion dotierten Proben wurde eine Matrixkalibration erstellt. Zusätzlich wurde Bier ohne Zusatz von OTA und eine Qualitätskontroll-Probe (10 ng OTA in Wasser) zur Methodenüberprüfung analysiert.

Sensitive Analyse von OTA mit Fluoreszenz-Detektion
Zur Analyse der Proben wurde eine Shimadzu Nexera XR UHPLC verwendet, die mit dem Fluoreszenz-Detektor RF-20Axs ausgerüstet war. Die Anregungswellenlänge betrug 335 nm und die Emissionswellenlänge 465 nm; die Detektorresponse wurde auf 1,5 s und die Sensitivität auf "hoch" gesetzt.

Als Trennsäule wurde eine 100 x 3 mm, 1,8 µm Nucleodur Phenyl-Hexyl-Säule (Macherey Nagel, Düren, Deutschland) verwendet. Das Injektionsvolumen betrug bei allen Messungen 10 µl. Die Flussrate der mobilen Phase (isokratisch 50/50 % (v/v) deionisiertes Wasser + 0,1 % Ameisensäure/Acetonitril (Sigma, Altenkirchen, Deutschland)) wurde auf 0,6 ml/min eingestellt.

Bild 1 zeigt die Kalibrationskurve für den Fall einer Direktinjektion eines mit 10 ng OTA dotierten Bierextrakts, der ohne vorhergehende Probenaufreinigung lediglich 5 min im Ultraschallbad entgast wurde. Die Nachweisgrenze (NWG) lag bei <0,1 ng/ml und die Bestimmungsgrenze
(BG) betrug 0,3 ng/ml bezogen auf die Messlösung.
Die Ergebnisse aus Bild 1 zeigen einen linearen Zusammenhang mit einem Bestimmtheitsmaß (R2) von 0,9999. Anhand dieser Daten wird ersichtlich, dass die Biermatrix keinen Einfluss auf die sensitive Bestimmung von OTA hat, da die Matrix als breite Elutionsbande zu Beginn des Chromatogramms eluiert, wie der schwarzen Chromatogrammspur in Bild 2 entnommen werden kann. Obwohl die Analyse der Bierextrakte somit auch ohne einen weiteren Aufreinigungsschritt möglich ist, führt der Eintrag großer Matrixmengen schnell zu einem deutlichen Verlust der Trenneffizienz.

Darüber hinaus ist es nicht möglich, das Injektionsvolumen zu erhöhen, da die Matrix sonst über einen noch größeren Bereich des Chromatogramms eluiert. Vor diesem Hintergrund sollte untersucht werden, welche der o.g. Aufreinigungsmethoden geeignet ist, die Matrix möglichst vollständig zu eliminieren. Nach der Probenaufreinigung mit einer MycoSpin-400-Säule, die normalerweise für die Aufreinigung von festem Probenmaterial verwendet wird, konnte die Biermatrix bereits deutlich reduziert werden (pinkes Chromatogramm in Bild 2).

Bild 2: Bier + 10 ng OTA ohne Probenvorbereitung (schwarz); Bier + 10 ng OTA mit Coring MycoSpinTM 400 (pink); Bier + 10 ng OTA mit LCTech otaCleanTMSMART (blau); Bier ungespiked mit LCTech otaCleanTMSMART (braun); QC Standard 10 ng OTA mit otaCleanTMSMART (grün).

Mit der Ionen-Affinitätssäule otaClean SMART, die speziell für die Probenaufreinigung von OTA in Bier entwickelt wurde, konnte die Matrix nahezu vollständig eliminiert werden (blaues Chromatogramm). Das braune Chromatogramm zeigt eine mit OTA dotierte Bierprobe, die mit einer otaClean-SMART-Säule aufgereinigt wurde. Im nicht-dotierten Bier lag die Konzentration von OTA <0,1 ng/ml, so dass kein Peak detektiert
wurde. Zum Vergleich zeigt das grüne Chromatogramm die Analyse mit einer wässrigen Standardlösung, die 10 ng OTA enthält.

Fazit
Die Ergebnisse der hier präsentierten Studie belegen, dass eine effektive Aufreinigung von Bierextrakten unter Verwendung der otaClean-SMART-Säule möglich ist. Somit ließe sich das Injektionsvolumen deutlich erhöhen, ohne dass die Trennsäule bereits nach wenigen Injektionen durch die völlige Überladung mit Matrix geschädigt wird.
Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die sensitive Erfassung von OTA mittels Fluoreszenzdetektion möglich ist, die in diesem Fall die teure, aufwendige massenspektrometrische Detektion ersetzt.

Anmerkung: MycoSpinTM ist eine unregistrierte Marke von Romer Labs. otaCleanTM ist eine unregistrierte Marke von LCTech.

Autoren:
Sascha Giegold
Shimadzu Deutschland GmbH
E-Mail: sg@shimadzu.de

Thorsten Teutenberg
Institut für Energie- und Umwelttechnik e.V.
E-Mail: teutenberg@iuta.de

Christoph Portner
Institut für Energie- und Umwelttechnik e.V.
E-Mail: portner@iuta.de

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