Kein anderer Skandal hat der pharmazeutischen Branche die Grenzen ihrer Qualitätskontrolle so aufgezeigt, wie der Heparinskandal im Jahr 2008. Vollkommen unerwartet traten damals nach der intravenösen Verabreichung von unfraktionierten Heparinlösungen in Europa vermehrt allergische Reaktionen und in den USA sogar Todesfälle auf. Die Ursache hierfür war die Streckung des Heparin-Wirkstoffes mit übersulfatiertem Chondroitinsulfat (OSDS), einem billigen Heparin-Imitat, welches von den zu diesem Zeitpunkt in den Arzneibüchern etablierten Analysen zur Qualitätskontrolle des Heparin-Wirkstoffes nicht erfasst werden konnte.

Die Besonderheiten einer Heparin-Gelformulierung
Im Vergleich zu Heparin-Injektionslösungen enthalten Heparin-Gelformulierungen zusätzlich noch einen Gelbildner. Hierbei handelt es sich um Makromoleküle wie beispielsweise Carboxymethylcellulose oder Polyacrylsäure, die bei ausreichend hoher Konzentration eine dreidimensionale kohärente Netzwerkstruktur ausbilden und damit die rheologischen Eigenschaften des Gels beeinflussen. Ähnlich wie Heparin, das ein hoch komplexes Gemisch aus hoch sulfatierten, nicht verzweigten Glycosaminglykanen darstellt, enthalten die Gel-bildner ebenso funktionelle Gruppen, die in Abhängigkeit des pH-Wertes ebenfalls geladen sein können (s. Bild 1).

Bild 1a: Darstellung eines Ausschnitts aus der Struktur von Heparin.

Während die Heparin-Analytik allein schon aufgrund der hohen Polarität und Heterogenität des Heparins eine besondere Herausforderung darstellt, kann sie in einer Gelformulierung durch die starke elektrostatische Interaktion mit dem Gelbildner zusätzlich erschwert sein. Darüber hinaus sind Interferenzen seitens des Gelbildners nicht auszuschließen. Im Folgenden werden daher die Vorteile und Nachteile diverser analytischer Lösungsansätze näher aufgezeigt.

Warum eine einfache photometrische Gehaltsbestimmung nicht ausreicht
Für eine einfache, routinetaugliche Methode zur Gehaltsbestimmung von Heparin und Glycosaminglykanen im Allgemeinen würde sich in erster Linie z.B. eine Reaktion mit einem kat- ionischen Farbstoff, wie etwa der DMMB- (1,9-Dimethylenmethylblau-)Assay, anbieten.

Begünstigt wird die Reaktion durch die zahlreichen Carboxyl- und Sulfatgruppen und der damit verbundenen hohen anionischen Ladungsdichte, weshalb Heparin über elektrostatische Wechselwirkungen und Van-der-Waals-Kräfte in der Lage ist, mit einer großen Anzahl an kationischen Farbstoffen zu reagieren. Der charakteristische Farb-Shift von Blau nach Vio-lett bei Zugabe von DMMB zu Heparin oder Glykosaminglykanen im Allgemeinen ist auf die Veränderung des Dimer/Monomer-Verhältnisses des Farbstoffes durch die Interaktion mit dem Polyanion zurückzuführen. Dadurch kommt es zu einer metachromatischen Verschiebung des spektralen Profils.

Bild 1b: Darstellung eines Ausschnitts aus der Struktur von Carboxymethylcellulose.

Allerdings können auch in der Gelformulierung eingesetzte polyanionische Gelbildner wie z.B. Carboxymethylcellulose mit DMMB reagieren. Um dies zu verhindern, empfiehlt es sich den pH-Wert der DMMB Lösung, der üblicherweise bei pH=3 liegt, auf pH=1,5 herabzusetzen. Bei diesem niedrigeren pH Wert liegen die Carboxylgruppen polyanionischer Gelbildner nämlich undissoziiert vor und können daher mit dem DMMB nicht reagieren. Anders verhält es sich mit den Sulfatgruppen der Glykosaminglykane, die bei diesem niedrigen pH-Wert weiterhin dissoziiert vorliegen und damit die Reaktion eingehen können [1, 2].

Obwohl sich diese Methode mit minimalem Zeit- und Kostenaufwand durchführen lässt und sich daher sehr gut für die Routineanwendung eignen würde, ist sie für die Anwendung in der Qualitätskontrolle von Heparin-Gelformulierungen eher nicht zu empfehlen, da sie keine Aussage zur Heparinaktivität ermöglicht und unter mangelnder Spezifität leidet.

Könnten chromatographische Lösungsansätze eine Alter-native darstellen?
Weitere in Frage kommende analytische Methoden zur Bestimmung von Heparin basieren auf der Detektion der abgespaltenen Di- saccharideinheiten nach erfolgter Depoly-merisation des Heparins mittels enzymatischen oder chemischen Verdaus unter Verwendung von Heparin-Lyase-Enzymen bzw. salpetriger Säure oder organischer Nitrate. Anschließend können die erhaltenen Disaccharideinheiten nach chromatographischer Trennung mittels Fluoreszenzdetektion oder Massenspektrometrie quantifiziert werden. Außerdem bietet sich auch die Größenausschlusschromatographie an. Erschwert wird die Anwendung dieser Methoden in Gelformulierungen jedoch durch die in Tabelle 1 (Seite 16) zusammengefassten Nachteile.

Bild 1c: Darstellung eines Ausschnitts aus der Struktur von Polyacrylsäure.

Könnten chromogene Lösungsansätze eine Alter- native darstellen?
Sowohl in der Ph.Eur. als auch in der USP wird zur Aktivitätsbestimmung von Heparin ein Faktor-IIa-abhängiger chromogener Substrattest beschrieben, bei dem die Konzentration von p-Nitroanilin photometrisch gemessen wird. Der Test beruht auf der Eigenschaft von Heparin, einen Komplex mit Antithrombin III (AT) zu bilden, der die Aktivität verschiedener Blutgerinnungsfaktoren, u.a. Thrombin (Faktor IIa) und Faktor Xa, hemmt. Bei einem Überschuss von AT ist die verbliebene Proteaseaktivität umgekehrt proportional zur Heparinkonzentration. Diese Rest- Aktivität des nicht gehemmten Blut- gerinnungsfaktors wird mit einem selektiven chromogenen Substrat bestimmt. Im Einzelnen laufen die folgenden Reaktio-nen ab:

1. Reaktionsschritt:
Heparin (Probe) + AT im Überschuss ➞ Heparin-AT-Komplex + AT (Rest)

2. Reaktionsschritt:
Heparin-AT-Komplex + Faktor IIa (im Überschuss) ➞ Heparin-AT-Faktor-IIa-Komplex + Faktor IIa (Rest)

3. Reaktionsschritt:
katalysiert durch Faktor IIa (Rest) Chromogene Substanz ➞ Peptid und p-Nitroanilin

Die durch die Freisetzung des Farbstoffes hervorgerufene Extinktionsänderung wird bei 405 nm gemessen und ist umgekehrt proportional zur vorhandenen Heparinaktivität.

Chromogene Assays können schnell und einfach mit kommerziellen arzneibuchkonformen Testkits durchgeführt werden. Sie bieten sich daher für die Gehaltsbestimmung von Heparin in Gelformulierungen im Rahmen der Qualitätskontrolle sehr gut an.

Da sie darüber hinaus für die Bestimmung der Heparinaktivität in Pufferlösungen konzipiert sind, muss die Gelformulierung für die Testdurchführung lediglich verdünnt werden. Einziger Nachteil dieses Assays ist dessen starke Abhängigkeit von minimalen Variationen

• beim Pipettieren von Probe/Reagenzien,
• in der Inkubationszeit,
• in der Temperaturverteilung.

Vor diesem Hintergrund ist es ratsam die Testdurchführung in der Routineanalytik zu automatisieren und für eine homogene Temperaturverteilung auf der Inkubationsfläche zu sorgen.

Bild 2: Struktur von 1,9-Dimethylmethylenblau.

Die regelmäßige Kalibrierung sollte vorzugsweise unter Verwendung des etablierten Routinetests an einer beispielhaften Konzentration der regulär in der Routine eingesetzten Referenzlösung durchgeführt werden. Zeigt sich bei der Kalibrierung, dass die im Vorfeld festgelegten Akzeptanzkriterien für die relative Standardabweichung nicht erfüllt werden, kann dies möglicherweise an folgenden Ursachen liegen:

• Pipettierprobleme,
• spektrophotometrische Probleme (Fluktuationen in der Absorptionsmessung),
• Mischungsprobleme (z.B. durch Luftblasen),
• Inkubationsprobleme (keine ausreichende Luftzirkulation).

Sind diese Probleme behoben, können auch mittels chromogener Assays sehr gute Regressionsgeraden mit einem Korrelationskoeffizienten >0,997 und einer exzellenten Wiederfindung erzielt werden. Um auch Variationen über die Zeit stets im Blick zu haben, ist es ratsam, Qualitätskontrollkarten anzulegen, um bei Abweichungen rechtzeitig handeln zu können.

Schließlich sollte in der Praxis besonderes Augenmerk auf die In-use-Stabilität und die Langzeitstabilität der verwendeten Reagen-zien gelegt und entsprechende Daten erhoben werden.

Tabelle 1: Überblick über die Vorteile und Nachteile diverser chromatographischer Lösungsansätze.

Nicht nur für Heparin, sondern auch für niedrigmolekulare Heparine sind chromogene Tests für die Aktivitätsbestimmung geeignet. Allerdings bietet sich in diesem Fall eher ein Anti-Faktor Xa-Test an, da niedrigmolekulare Heparine primär eine Anti-Xa-Aktivität ausüben [5].

Fazit
In der Praxis gestaltet sich die Qualitätskontrolle von Heparin in Gelformulierungen besonders schwierig, da die Gelmatrix mit diversen analytischen Verfahren interferieren kann. Vor diesem Hintergrund ist es ratsam, auch für Gelformulierungen die Gehaltsbestimmung über einen chromogenen Assay durchzuführen. Diese Tests sind nicht nur spezifisch, sondern ermöglichen auch Aussagen über die Aktivität des in der Gelformulierung verarbeiteten Heparins.

Literatur
[1] Liu Q, Jiao Q. Mechanism of methylene blue action and interference in the heparin assay. Spectroscopy Letters 1998; 31: 913-924.
[2] Zheng C, Levenston ME. Fact versus artifact: Avoiding erraneous estimates of sulfated glycosaminglycan content using the dimethylene blue colorimetric assay for tissueengineered constructs. Eur Cell Mater 2015; 29: 229-236.
[3] Osago H, Shibata T, Hara N, Kuwata S, Kono M, Uchio Y, Tsuchiya M. Quantitative analysis of glycosaminglycans, chondroitin/dermatan sulfate, and keratin sulfate by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry. Anal Biochem 2014; 467: 62-74.
[4] Matanoviæ MR, Grabnar I, Grabnar PA, Roškar R. Development and validation of a simple and sensitive size-exclusion chromatography method for quantitative determination of heparin in pharmaceuticals. Acta Pharm 2015; 65: 43-52.
[5] Dalmora SL, Sangoi MDS, Barth T, Brum L Jr, VAccari SF. Validation of teh antifactor Xa and antifactor IIA assays for the potency assessment of nadroparin in pharmaceutical formulations. J AOAC Int 2006; 89: 58-64.

Prof. Dr. Mona Tawab
Zentrallaboratorium Deutscher Apotheker e.V.
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