HPLC-Tipp

Was beeinflusst Peakfläche und Retentionszeit?

Wie in jedem Jahr, wollen wir uns – liebe HPLC-Anwenderinnen, liebe HPLC-Anwender – in den Sommermonaten mit kleinen Tipps beschäftigen; betätigen wir uns in diesem Monat ein wenig „sportlich“ und betrachten Folgendes:

Dr. Stavros Kromidas, Breslauer Str. 3, 66440 Blieskastel, www.kromidas.de

Jeder von uns macht in seinem (HPLC-)Alltag mechanisch Handgriffe, die richtig und dienlich sind; auch werden erwartete Ergebnisse als selbstverständlich angesehen – es funktioniert ja alles prima… Wenn man allerdings dann zu einem Tatbestand „dumme“ Fragen stellt, kommt man vielleicht doch ins Grübeln und fragt sich: „Moment mal, wieso ist es eigentlich so?“ Nachfolgend formuliere ich jeweils drei solcher Fragen, und zwar einmal zur Peakfläche und einmal zur Retentionszeit. Ich schlage vor, Sie beantworten sie zunächst einmal für sich. Im Juli/August-Tipp werde ich auf diese Fragen dann mit kurzen Kommentierungen und Erläuterungen eingehen.

Stellen wir uns für die nachfolgenden Fragen übliche HPLC-RP-Läufe mit einem konzentrationsabhängigen Detektor, z.B. einem UV-Detektor, vor.

Peakfläche und konzentrationsabhängiger Detektor
1. Nehmen wir an, am Eingang zum Detektor tritt eine Leckage auf und ein Teil der Probe geht dadurch verloren. In diesem Fall nimmt zwar die Probenmasse (absolute Anzahl der Substanzmoleküle) in jenem Segment des Eluenten, in dem die Probe sich befindet, ab, die Konzentration aber (Anzahl der Substanzmoleküle pro Volumeneinheit) bleibt konstant. Das bedeutet also, die Peakfläche muss konstant bleiben – oder?

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2. Wenn ich 10 µl injiziere, bekomme ich eine Peakfläche von beispielsweise 5000 Flächeneinheiten. Wenn ich nun 20 µl injiziere, injiziere ich zwar die doppelte Menge an Molekülen, diese Moleküle befinden sich aber in einem doppelten Volumen, die Konzentration bleibt dadurch konstant und damit müsste die Peakfläche auch konstant bleiben. Tut sie aber nicht – wieso nicht?

3. Ich injiziere 10 µl bei einem Fluss von 1 ml/min, es ergibt sich eine Fläche von 10 000 Flächeneinheiten. Ich injiziere noch einmal diese 10 µl, diesmal bei 2 ml/min. Da ich ja 100 % das Gleiche injiziert habe, müsste die Peakfläche konstant bleiben – die Peakhöhe lassen wir im Moment außer Acht. Tut sie das wirklich, und wenn nicht, wieso nicht?

Retentionszeit in einem RP-System
1. Ich injiziere in einem RP-System polare Komponenten. Sie eluieren früh und wenn ich den wässrigen Anteil im Eluenten erhöhe, eluieren sie später. Wieso eigentlich? Was ist an folgender Argumentation falsch? Polare Analyte müssten sich im polarer gewordenen Eluenten nun wohler fühlen („Ähnliches mit Ähnlichem“); sie würden vom Eluenten eher mitgenommen und müssten demnach später eluieren…

2. Benzylamin ist eine starke Base; wieso eluiert eine derart polare Komponente an einer LiChrospher- oder an einer Zorbax ODS-Säule (beide Materialien weisen eine starke Belegung mit C18-Alkylketten auf, folglich sind starke hydrophobe Wechselwirkungen möglich) später als eine hydrophobe, neutrale Komponente wie beispielsweise Toluol?

3. Ich injiziere meine Probe und erhöhe –nach dem Erhalt einer (passablen) Trennung – anschließend den Acetonitril-Anteil im Eluenten. Doch dies führt dazu, dass einige Peaks auf einmal koeluieren, ihre Elutionreihenfolge ändern oder urplötzlich ein Tailing aufweisen. Wieso kann dieser, eigentlich „harmlose“ Schritt solche drastische Erscheinungen als Folge haben?

Ich wünsche Ihnen gute Gedanken, eine sonnige Zeit und bis zum nächsten Monat.

Ihr Stavros Kromidas

© by Stavros Kromidas
http://www.kromidas.de

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