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Der HPLC-Tipp im September

Die Auflösung – verschiedene Formeln, verschiedene Ergebnisse

Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Die Auflösung ist - vereinfacht gesagt - der Abstand zwischen zwei Peaks an der Basislinie. Sie hängt von der absoluten Stärke der Wechselwirkungen der zwei Komponenten (Kapazität, Retentionsfaktor k), von dem Verhältnis der Wechselwirkungen der zwei Komponenten (Selektivität, Trennfaktor ¿) und von der Peakform (Effizienz, Bodenzahl N) ab. Die Auflösung wird als das wichtigste Kriterium für die "Güte" einer Trennung angesehen. So wird oft eine Mindestauflösung verlangt, auch werden Auflösungen zum Methodenvergleich herangezogen. Es ist nun so, dass es mehrere Formeln für die Auflösung gibt, die alle mehr oder weniger benutzt werden. Es liegt somit auf der Hand, dass Ergebnisse nicht immer vergleichbar sind. Es stellt sich jetzt die Frage: Wie stark können sich Werte unterscheiden, wenn zu deren Ermittlung unterschiedliche Formeln zugrunde liegen?

Die Lösung

Weiter unten sind unterschiedliche Formeln für die Aufl ösung aufgeführt. Diese Zusammenstellung wurde freundlicherweise von Dr. Hans-Joachim Kuss zur Verfügung gestellt. Herr Kuss hat auch ein EXCEL- Makro geschrieben, damit kann man für die eingegebenen Retentionswerte und Bodenzahlen Aufl ösungen nach den unterschiedlichen Formeln errechnen. Die ersten zwei Formeln werden häufig in der Pharma verwendet, beide sind in der USP enthalten. Hier können die notwendigen Zahlenwerte (Retentionszeit und Peakbreite) direkt dem Chromatogramm entnommen werden. Die restlichen Formeln, für die der Retentionsfaktor, der Trennfaktor und die Bodenzahl benötigt werden, sind nach den Autoren genannt: Nach Purnell, nach Knox und nach Said. Eine Diskussion, welche Formel wann vorzuziehen ist, würde den Rahmen hier bei weitem sprengen. Vielmehr wollen wir für einige Zahlenbeispiele die sich ergebenden Werte für die Aufl ösung vergleichen und Rückschlüsse ziehen. In Tabelle 1 sind für bestimmte Retentionszeiten, Totzeiten und Selektivitäten die Werte für die Aufl ösung aufgeführt, die sich nach den unterschiedlichen Formeln ergeben (Reihenfolge wie oben).

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Bemerkungen, Konsequenzen

Vorbemerkung: Die Auflösung wird üblicher- und vernünftigerweise mit einer Stelle nach dem Komma angegeben. Hier habe ich absichtlich drei Werte nach dem Komma berechnet, um die Unterschiede vielleicht etwas besser darzustellen.

  • Die Werte nach den ersten zwei Formeln und nach Said sind sehr ähnlich, nur bei sehr stark tailenden Peaks ergeben sich merklich unterschiedliche Werte. In diesem Fall liefert eher die erste Formel die realistischeren Werte und wäre vorzuziehen (die Berechnung der Bodenzahl bei stark tailenden Peaks ist mit Fehlern behaftet ¿ Said ¿ und die Verwendung der Peakbreite auf halber Höhe "verdeckt" ein eventuelles Tailing).
  • Nach Purnell ergeben sich die kleinsten, nach Knox die größten Werte.
  • Je größer die Werte für die Selektivität, umso ungenauer werden die Werte für die Auflösung nach Knox.
  • Je früher die Peaks eluieren, umso ähnlicher sind die Werte für die Auflösung nach den unterschiedlichen Formeln. So liegt beispielsweise der Wert nach Knox bei einer Retentionszeit von 4 min für den ersten Peak um ca. 10 % höher als nach Purnell (2,550 vs. 2,316). Eluiert dagegen der erste Peak nach 7,1 min, liegt die Differenz bei ca. 15 % (3,188 vs. 2,825).
  • Eine Verdoppelung der Retentionsfaktoren bei nahezu gleichbleibender Selektivität (1,17 vs 1,18, Spalte 2 und 3) führt ¿ wie zu erwarten ¿ zwar zu einer merklichen, aber keinesfalls signifikanten Verbesserung der Auflösung. Ähnlich verhält es sich mit den Bodenzahlen (Werte hier nicht gezeigt).
  • Wird die Selektivität von 1,17 auf 1,50 erhöht, ergibt sich eine enorme Verbesserung der Auflösung (vergleiche Spalte 1 und 4). Auch die Differenz der Werte nach Purnell und Knox (kleinster vs. größtem Wert) erhöht sich auf ca. 27 %: 8,351 vs. 11,482. Also: Je selektiver eine Methode ist, umso unterschiedlicher sind die Werte für die Auflösung,

Das Fazit

  • Formel Nr. 1 hat sich im Alltag zu Vergleichszwecken bewährt.
  • Formel Nr. 3 wird häufi g für isokratische, Formel 4 für Gradiententrennungen verwendet.
  • Formeln 3 bis 5 liefern folgenden Vorteil: Man sieht direkt, in wieweit Veränderungen von k, und N die Auflösung beeinflussen ¿ evtuell hilfreich bei Optimierungs- und Robustheitsexperimenten.
  • Wenn als Kriterium nur eine Zahl für die Aufl ösung genannt wird, aber nicht die Formel für deren Berechnung, sollte man ruhig Formel Nr. 4 verwenden¿

© by Stavros Kromidas, www.kromidas.de

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