HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp


Der Fall
In nahezu jedem Regelwerk wird „expressis verbis“ vermerkt, dass die Auswertung sowohl über die Peakfläche als auch über die Peakhöhe erfolgen kann. Dennoch hat sich in der Praxis bis auf wenige Ausnahmen die Auswertung über die Peakfläche etabliert. Ich bin Realist genug zu wissen, dass sich diesbezüglich kaum etwas Grundsätzliches ändern wird. Es lohnt sich allerdings schon, sich einige Fakten bewusst zu machen.

Die Lösung

Zur Vorbereitung für ein Buch über Integration und Auswertung [1] haben wir uns intensiv mit dem Thema „Integration“ auseinandergesetzt. Dr. H. J. Kuss hat verschiedene Software auf ihre Fähigkeit zur „richtigen“ Integration hin untersucht. Dazu hat er ein Makro entwickelt, das u.a. Folgendes ermöglicht: Eine bekannte (und damit richtige) Fläche wird vorgegeben; anschließend kann überprüft werden, in wie weit diese Fläche von der jeweiligen Auswertesoftware tatsächlich auch gefunden wird. Mit dem Ziel, ein möglichst umfangreiches, realistische Bild zu erhalten, wurden mehrere reale Chromatogramme von befreundeten Unternehmen mit allen möglichen chromatographischen „Schikanen“ eingescannt: Große Peaks neben kleinen Peaks, kleiner Peak an der Flanke eines großen Peaks, nicht aufgelöste Peaks, tailende Peaks, driftende Basislinie, Peaks in der Nähe der Bestimmungsgrenze, usw. Danach wurden die AIA-Files in mehrere kommerzielle Softwareprogramme importiert und nach verschiedenen Verfahren ausgewertet: Peakhöhe sowie Peakfläche bei diversen Varianten wie Valey to Valey, Lotfällung, Tagenten-Methode, etc. Details finden sich in [1] und [2], hier seien einige Befunde in verdichteter Form wiedergegeben:

Anzeige
  • Bei einem Peak/Rausch von 10:1 (häufig als die Bestimmungsgrenze angesehen) ist der Fehler bei einer Auswertung über die Fläche selten kleiner als 10 %, die Auswertung über die Höhe erlaubt dagegen in optimalen Fällen Fehler von „nur“ ca. 3...5 %.
  • Werden bei schnellen Peaks nur 15...25 Datenpunkte zur Beschreibung eines Peaks verwendet, sind bei nicht-aufgelösten Peaks bei der Flächenauswertung Fehler von 10, 20 oder gar 30 % keine Seltenheit. Eine Auswertung über die Peakhöhe stellt hier das kleinere Übel dar, weil die Peakhöhe von der Peaküberlappung weniger beeinflusst wird. So auch bei tailenden, nicht-aufgelösten Peaks: Der Fehler der Integration (Flächenauswertung, Lotfällung) liegt nur bei gleich großen Peaks in der Größenordnung von 20 %. Im Falle von kleineren Peaks an der Flanke kann der Fehler 50...100 % betragen. Wenn „par tout" über die Fläche ausgewertet werden soll, dann sollte man hier eher die Variante Gaussian/Exponential Skim vorziehen, für Empower-Anwender empfiehlt sich eher „Apex Track“ als „Traditional“.
  • Es hat sich gezeigt, dass neben der Richtigkeit auch die Präzision bei der Höhenauswertung besser ist: Der VK der Peakhöhe ist in aller Regel (einer der wenigen Ausnahmen: sehr kleine, sehr breite Peaks) kleiner als der der Peakfläche.
  • Im Falle von nicht-robusten Methoden (z.B. Verschiebung der Retentionszeit aufgrund von instabilem pH-Wert im Eluenten) ist natürlich die Auswertung über die Peakfläche vorzuziehen, da ja in diesem Fall die Peakhöhe, aber nicht die Peakfläche, sich ändert. Da früher die Methoden nicht so robust waren, dürfte dies einer der wichtigsten Gründe für den Siegeszug der Peakfläche sein.

    Das Fazit
    Eine ausführliche Diskussion ist im hier vorgegebenen Rahmen nicht möglich, daher an dieser Stelle nur zwei Empfehlungen:

1. Nach der automatischen Integration zoomen Sie bitte das Chromatogramm so, dass Sie in einer starken Vergrößerung am Bildschirm überprüfen können, wie Ihr Integrationsprogramm tatsächlich integriert hat. Tun Sie es auch im Falle von „gut“ aussehenden Chromatogrammen! Ich habe manche Überraschung erlebt...

2. Variieren Sie – es reichen auch minimale Änderungen aus – wichtige Aufnahmeparameter wie z.B. threshold und sample rate sowie Integrationsparameter wie z.B. time constant (oder response time oder rise time oder filter time) und touchdown und überprüfen Sie deren Einfluss auf die Peakfläche und damit auf die Richtigkeit (absoluter Wert in counts, Finden von Peakanfang und Peakende).


Literatur

  1. Kromidas, S./ Kuss, H.J. (Hrsg.) Chromatogramme richtig integrieren und bewerten, Wiley-VCH, ISBN 978-3-527-31774-5.
  2. Kuss, H.-J., Kromidas, S. , in Vorbereitung
    © by Stavros Kromidas
Anzeige

Das könnte Sie auch interessieren

Anzeige

HPLC-Tipp

Sehr kleine Peaks – was kann ich tun?

Nehmen wir an, Sie müssen Komponenten in einer extrem geringen Konzentration quantifizieren – die Peaks sind einfach sehr klein. Es geht also im vorliegenden Fall vordergründlich nicht um eine gute Auflösung, es geht um eine gute Detektierbarkeit.

mehr...
Anzeige
Anzeige