Labortipps

Tipps für höhere Empfindlichkeit in der LC-MS

Analytik-Spezialist Dr. Stephan Altmaier von Merck gibt Tipps und Empfehlungen für die Praxis im Labor, die Anwendern helfen können, optimale Ergebnisse von HPLC-MS-Systemen zu erzielen.
© Merck KGaA

Voraussetzung für jede hochempfindliche Analyse mittels HPLC-MS (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie) ist die Verwendung von hochreinen Lösungsmitteln und Reagenzien sowie der sorgfältige Umgang mit allen zugehörigen Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Systemen. So wird jegliche Kontamination während des gesamten Analysenablaufs von der Probenvorbereitung bis hin zur MS-Detektion vermieden und damit die Empfindlichkeit erhöht.

In den folgenden Abschnitten werden verschiedene Maßnahmen und Optionen zur Sicherstellung einer maximalen LC-MS-Empfindlichkeit und niedriger Nachweisgrenzen (NWG) aufgezeigt. Durch jeden einzelnen Tipp werden Kontaminationen vermieden, die zu Signalsuppression, Bildung von Addukten, stärkerem Hintergrundrauschen und erhöhter Komplexität des Spektrums führen können.

Lösungsmittel und Additive – Allgemeines

Zu den typischen Lösungsmitteln, die in der LC-MS verwendet werden gehören Wasser, Acetonitril, Methanol, Isopropanol und n-Propanol. Additive wie Säuren (z. B. Ameisensäure), Basen (z. B. Ammoniak) oder Puffer (z. B. Ammoniumacetat) werden verwendet, um die Protonierung oder Deprotonierung der Analyten zu ermöglichen und zu kontrollieren.

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Die Qualität der vorgenannten Lösungsmittel und Additive hat einen starken Einfluss auf die Empfindlichkeit der MS-Detektion; daher ist die Verwendung von hochreinen Lösungsmitteln und Additiven in MS-Qualität zwingend erforderlich. Der Anwender sollte sicherstellen, dass diese Reagenzien vom Hersteller als LC-MS-Qualität ausgewiesen sind.

Im Allgemeinen sind organische Lösungsmittel für die HPLC wie Acetonitril und Methanol in drei Qualitäten erhältlich: Für isokratische Methoden, für Gradientenmethoden und für die LC-MS. Ein für die MS-Analyse geeignetes Lösungsmittel ist z. B. „LiChrosolv® hypergrade“ für die LC-MS.

Reinstwasserqualitäten können aus Flaschen oder aus Wasseraufbereitungssystemen bezogen und in LC-MS-Systemen verwendet werden. Bei geringem Wasserverbrauch ist Wasser in Flaschen vorzuziehen, während Reinstwasser aus Wasseraufbereitungssystemen bei höherem Verbrauch empfohlen wird. So liefern z. B. geeignete Milli-Q®-Systeme Reinstwasser vom Typ I – ideal zur LC-MS-Analyse. Sie sollten regelmäßig verwendet beziehungsweise gespült werden, um die Wasserqualität zu erhalten oder sogar noch weiter zu verbessern.

Puffer dienen der Einstellung und Kontrolle des pH-Werts einer spezifischen chromatographischen Trennung und zur Protonierung oder Deprotonierung der Analyten, was den Elektrospray-Ionisierungsprozess unterstützen kann. Für die LC-MS sollten nur flüchtige Puffer und Additive wie Ammoniumformiat oder -acetat oder Triethylamin verwendet werden. Die Verwendung von nichtflüchtigen Puffern (wie z. B. Sulfaten, Phosphaten, Boraten) führt zur Bildung von Ablagerungen in der MS-Quelle und resultiert in einer aufwändigen Reinigung. Hohe Pufferkonzentrationen können zur Signalsuppression führen.

Mit Puffern wird ein Analytmolekül M ionisiert, jedoch ist auch die Bildung von Addukten [M+Puffer] mit z. B. Ammonium, Formiat oder Acetat möglich. Dies verursacht zusätzliche Signale mit spezifischen m/z-Werten im Spektrum, wodurch die quantitative Analyse beeinträchtigt werden kann. Daher wird für Proben mit hoher Salzbelastung wie Lebensmittel, Körperflüssigkeiten oder -gewebe ein Entsalzungsschritt mittels Festphasenextraktion (SPE) empfohlen (z. B. mit „Supel™Swift HLB“ oder „LiChrolut®“- und „Discovery® SPE“-Kartuschen).

Puffer sollten idealerweise durch Titration der jeweiligen Säure und Base hergestellt werden, da deren Reinheit typischerweise höher ist als die der zugehörigen Salze. Wenn die Verwendung von Salzen zweckmäßiger ist, wird vor der Anwendung eine MS-Analyse der verwendeten Salze empfohlen, um festzustellen, ob und wenn ja, welche Kontaminationen in den Salzen vorhanden sind.

Bild 1. Anreicherung von Kontaminanten auf einer HPLC-Säule während der Equilibrierung (für A: null, B: 15 und C: 60 Minuten) und Elution über einen Gradientenlauf. Die den Weichmachern zugeordneten Peaks sind mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet. (Probe: Weichmacher, die durch das Einweichen von Kunststoffschläuchen in wässriges Lösungsmittel A ausgelaugt wurden; Bedingungen: Gerät: Bruker Esquire 6000plus; mobile Phase: A: Wasser/Acetonitril 95/5 (v/v) + 0,1 % Ameisensäure und B: Aceto­nitril + 0,1 % Ameisensäure; Gradient: 0 min 100 % A, 3 min 5 % A, 2 min 5 % A; Flussrate 0,4 ml/min; 25 °C; Detektor: pos. ESI-MS (TICs).) © Merck KGaA

Verunreinigungen in Lösungsmitteln und Additiven, ob von vornherein enthalten oder eingeschleppt, können sich auf der stationären Phase anreichern und als Geisterpeaks bei Gradientenläufen eluieren (Bild 1). Dieses Szenario kann auftreten, wenn z. B. die RP-Säule vor einem Gradientenlauf unter stark wässrigen Bedingungen equilibriert wird. Geisterpeaks können sogar ohne Equilibrierung auftreten, wenn die Konzentration und/oder Retention von Kontaminanten hoch ist und/oder die Ausgangsbedingungen eines Gradienten stark wässrig sind. Um Geisterpeaks in Gradientenmethoden zu vermeiden, muss die Säulenequilibrierungszeit so kurz wie möglich gehalten werden und das Spülvolumen zehn Säulenvolumina nicht überschreiten.

Starke Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Salpetersäure müssen vermieden werden, da sie dazu neigen, starke Ionenpaare mit den Analyten zu bilden und der Analyt damit für jede Art von Ionisierung unzugänglich wird. Darüber hinaus besitzen einige dieser starken Säuren ungünstige oxidative Eigenschaften.

Viele Labore verwenden Trifluoressigsäure (TFA), um Ionenpaare mit Peptiden und Proteinen zu bilden und die anschließende HPLC-Trennung zu verbessern; TFA verursacht jedoch eine starke Ionensuppression der Analyten während der MS-Detektion und kann darüber hinaus das Massenspektrometer kontaminieren. Falls die Verwendung von TFA dennoch erforderlich ist, sollte eine schwache Säure oder Isopropanol hinzugefügt werden, um den Effekt der Signalsuppression zu reduzieren. Alternativ stellt Difluoressigsäure (DFA) eine Option dar, den Signalunterdrückungseffekt zu verringern (im Vergleich zur Verwendung von TFA).

Lösungsmittel und Additive – Lagerung und Handhabung

Lösungsmittel sollten in der Originalflasche des Herstellers aufbewahrt werden. Diese kann entweder aus oberflächenbehandeltem Braunglas oder Borosilikatglas gefertigt sein. Es wird eine Auswahl der Flaschengröße entsprechend der spezifischen Anforderungen empfohlen, da ein Umfüllen/Dekantieren in einen anderen Behälter eine Kontaminationsquelle darstellt und möglichst vermieden werden muss. Standard-Klarglas- oder Kalk-Natron-Glasflaschen sind wenig geeignet, da ausgelaugte Alkali-Ionen und Kieselsäure Addukte mit Analyten bilden können. 

Die Flaschen müssen direkt und dicht an das HPLC-System angeschlossen werden. Dabei sind speziell geeignete Verschlusskappen, Adapter und Schläuche zu verwenden, die direkt auf die Lösungsmittelflasche aufgesetzt werden. Jede hausgemachte oder improvisierte Installation führt über Undichtigkeiten mit hoher Wahrscheinlichkeit zu einer Kontamination des Lösungsmittels oder Eluenten und kann einen Austritt organischen Lösungsmittels in die Laborluft zur Folge haben.

Bild 2: Massenspektren von zwei Milli-Q®-Wasserproben, die in Polypropylenflaschen (A) und sauberen Braunglasflaschen (B) gelagert wurden (untere zwei Abbildungen), und TICs dieser Proben (obere Abbildung). Die Analysen wurden durch direkte Injektion der Lösungsmittel in die im positiven ESI-Modus laufende MS durchgeführt. © Merck KGaA

Hilfsmittel aus Kunststoff wie Flaschen, Trichter, Becher oder Handschuhe, aus denen Additive wie Weichmacher, Antistatikmittel, Stabilisatoren oder Antirutschmittel auslaugen können, sind zu vermeiden (Bild 2). Die einzige Ausnahme stellen Geräte dar, die vom jeweiligen Hersteller auf „Leachables & Extractables“ geprüft wurden, wie z. B. Pipettenspitzen oder Spritzen.

Laborausstattung

Die Reinigung von Laborgeräten und Gefäßen kann am einfachsten durch ein Abdampfen im Abzug erfolgen, da alle in MS-Anwendungen verwendeten Reagenzien flüchtig und von hoher Reinheit sind. In Fällen, in denen eine Kontamination beobachtet wird, ist ein Spülen mit Lösungsmittel(n) in MS-Qualität erforderlich, um sicherzustellen, dass die Geräte ausreichend gereinigt sind.

Falls eine Spülmaschine verwendet werden muss, ist es entscheidend, dass die Gefäße nach dem Spülgang mehrmals mit einem Lösungsmittel in MS-Qualität nachgespült werden.

HPLC-Säule

Die Wahl der HPLC-Säulenabmessungen richtet sich nicht nur nach Faktoren wie Probengröße, Detektionstechnik und notwendiger Beladbarkeit, sondern auch nach wirtschaftlichen Gesichtspunkten wie der Reduzierung des Lösungsmittelverbrauchs. Eine Verringerung des Säuleninnendurchmessers (I. D.) bei entsprechender Anpassung des Injektionsvolumens und der Flussrate ist ein einfaches Mittel, welches zudem typischerweise auch die Empfindlichkeit einer gegebenen Trennung erhöht.

Bild 3. Quantifizierung des HILIC-Säulenblutens verschiedener Säulen von Merck im Vergleich zu alternativen Produkten, gemessen mittels Massenspektrometrie. A: Merck Purospher® STAR Si 100-2.1, B: Merck ZIC®-HILIC 100-2.1, C: Marke A HILIC 100x2.1 (Normalphasenmaterial), D: Marke B HILIC 100x2 (Ammonium-Sulfonsäure), E: Marke C HILIC 100x2 (Phosphorylcholin), F: Marke D HILIC 100x2.1 (Ammonium-Sulfonsäure). Bedingungen: Säule wie angegeben; mobile Phase: Acetonitril/25 mM Ammoniumacetat; pH 6.8 80/20 (v/v), 6 min; Fluss: 0,8 ml/min; Temperatur: 50 °C; Detektor: Ionenfallen-MS (m/z 50-2 000); Detektionsdauer fünf Minuten. © Merck KGaA

Eine mögliche und häufige, aber oft übersehene Kontaminationsquelle bei einer LC-MS-Methode ist die Chromatographiesäule selbst. Viele der Kieselgel-basierten gebundenen Phasen neigen von Natur aus zur Phasenablösung durch Hydrolyse, hauptsächlich bei saurem pH-Wert (z. B. unter pH 2), ein Phänomen, das als Säulenbluten bezeichnet wird (Bild 3). Die Verwendung eines Spülprotokolls kann dabei helfen, den negativen Effekt des Säulenblutens zu verringern. Alternativ sollte eine Säule vor dem Einsatz in der LC-MS bis zu zehn Gradientenläufe, von stark wässrig bis stark organisch, durchlaufen.

HPLC-System

Auch das richtige Setup des HPLC-Systems selbst kann zur Erhöhung der Empfindlichkeit beitragen. Ein wichtiger Parameter ist die Minimierung des Totvolumens, d. h. des Volumens aller Systemteile vom Injektor bis zur Detektorzelle abzüglich des Volumens der HPLC-Säule. Hohe Totvolumina können zu Peak-Verbreiterung, -Tailing oder -Splitting führen, eine schlechte Auflösung und geringere Leistungsfähigkeit zur Folge haben und damit die Empfindlichkeit verringern und den Nachweis niedrig konzentrierter Analyten verhindern oder erschweren. Folglich müssen alle Systemteile (Schläuche, Anschlüsse, Fittings) so gewählt werden, dass das Totvolumen minimiert wird.

Pumpeneinlassfilter müssen alle ein bis zwei Monate oder nach einem Lösungsmittelwechsel von

Acetonitril zu Methanol (oder umgekehrt) ersetzt werden. Durch diese Wartung wird das Grundlinienrauschen gesenkt und das System und die Säule werden vor Verunreinigung aus der Pumpe geschützt.

Eluentenfilterfritten (in Lösungsmitteleinlassfiltern) sollten bevorzugt aus Edelstahl oder PEEK und nicht aus Glas bestehen. Die Reinigung der zuletzt genannten ist mühsam, da Pufferrückstände schwer zu entfernen sind und Silikat und Alkali aus dem Glasfilter ausgelaugt werden und Addukte bilden können.

Allgemeine Empfehlungen

Die spezifischen Anforderungen verschiedener chromatographischer Fragestellungen können die Verwendung unterschiedlicher Zusammensetzungen der mobilen Phasen von wässrig bis organisch erforderlich machen. Als allgemeine Empfehlung sollte der wässrige Anteil in einem Eluenten, der in der LC-MS verwendet wird, auf 5 bis 80 % eingestellt werden, um störungsfrei und mit einem stabilen Spray arbeiten zu können.

Liegt der Wassergehalt unter 5 %, können Puffer im stark organischen Eluenten ausfallen. Eine Gegenmaßnahme kann die Verwendung eines organischen Lösungsmittels sein, in dem sich der Puffer besser löst, oder eine Verringerung der Pufferkonzentration im Eluenten. Die Löslichkeit des Puffers in den verwendeten Lösungsmitteln (und der mögliche Gradientenbereich) sollten immer vor der Analyse überprüft werden. Ein Wassergehalt von mehr als 80 % kann zu einem Ausfall des MS-Sprays führen. Falls mit einer derartigen Eluentenzusammensetzung gearbeitet werden muss, wirken folgende Maßnahmen einem Zusammenbruch des Sprays entgegen: 

  1. Senken der Oberflächenspannung des Eluenten durch Zugabe eines flüchtigen organischen Lösungsmittels wie Acetonitril oder Methanol zur mobilen Phase, und zwar nach dem LC-System (nach der Säule) und vor der MS-Quelle.
  2. Reduzierung des in die MS-Quelle gehenden Flusses durch einen Split oder Wechsel der Säule (geringerer I.D.).
  3. Veränderung der MS-Quellbedingungen (Erhöhung der Temperatur oder des Flusses des Trocknungsgases).

Um eine mikrobielle Kontamination sowohl des Systems und der mobilen Phase als auch einen Phasenkollaps der stationären C18-Phase zu vermeiden, sollte der Wassergehalt der mobilen Phase nicht über 95 % betragen. Falls eine stark wässrige mobile Phase erforderlich ist, kann dem Eluenten 0,05 % Natriumazid zugesetzt werden, um mikrobielles Wachstum zu verhindern. Alternativ dazu ist ein regelmäßiges Spülen des HPLC-Systems mit organischem Lösungsmittel, vorzugsweise Isopropanol oder Methanol, vor dem Standby-Betrieb erforderlich. Acetonitril ist hier nicht geeignet, da ggf. enthaltene Verunreinigungen Systemventile blockieren können.

Schlussfolgerung

Die Massenspektrometrie ist eine leistungsstarke Technik zur Identifizierung und Quantifizierung von Molekülen in komplexen Gemischen. Erfolgreiche Analysen sind von der Reduzierung von Kontaminationen während des gesamten LC-MS-Workflows abhängig, angefangen bei der Probenvorbereitung bis hin zur Reinigung der verwendeten Geräte. Ein wichtiger erster Schritt in diesem Prozess ist, dass – ob Lösungsmittel, Puffer, Reagenzien oder Säulen – ausschließlich Materialien höchster Qualität bzw. Reinheit verwendet werden. Mit der Kombination aus hochreinen Lösungsmitteln und Reagenzien mit kontaminationsfreier Handhabung lassen sich maximale LC-MS-Empfindlichkeiten und niedrige Nachweisgrenzen (NWG) erzielen.

Weitere Informationen zu Lösungen und Hilfsmitteln für die LC-MS sind unter SigmaAldrich.com/lc-ms zu finden.

AUTOR
Dr. Stephan Altmaier
Principal Scientist/Advanced Analytical
Merck KGaA, Darmstadt
www.merckgroup.com

Referenz:
First published in Chromatography Today (2017) Issue 4

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