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Die Metabolomics-Daten aus dem Projekt FoCus

Veränderungen im Metabolom liefern Einblicke in zugrundeliegende biochemische Prozesse. Die Analyse der Metabolome von 2 000 Probanden der Kieler FoCus-Kohorte stellt Daten bereit, die als Basisinformationen für weitere Projekte genutzt werden.

Bild 1: „omics“-Kaskade, beginnend mit Genomics (Messung aller Gene), Transcriptomics (Messung der mRNA-Sequenzen), Proteomics (Detektion aller Proteine) sowie Metabolomics (Messung aller Stoffwechselprodukte). © Uni Kiel

Das Kürzel FoCus steht für „Food Chain Plus“ und ist ein vom BMBF gefördertes Kompetenznetz (2010 – 2018), in dem zahlreiche Fragestellungen entlang der gesamten Wertschöpfungskette Milch bearbeitet wurden: die Fütterung von Milchkühen, die Funktionalisierung von Milchinhaltsstoffen und deren gesundheitliche Wirkung sowie das Konsumentenverhalten. Das Kompetenznetz wurde unter Federführung der Agrar- und Ernährungswissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel etabliert, und es beteiligten sich weitere Partner aus Wissenschaft und Wirtschaft, um eine ganzheitliche Betrachtung des Themas durchführen zu können. Zum Abschluss des Projekts wurde ein gemeinsamer Abschlussbericht verfasst (zum Download: http://www.focus.uni-kiel.de).

Für die Kieler FoCus-Kohorte wurden 2 000 Probanden detailliert phäno- und genotypisiert, um neue Erkenntnisse über ernährungsbedingte Erkrankungen zu gewinnen. Dazu wurde auch mit Metabolomics-Methoden das Metabolom der Probanden analysiert. Metabolomics ist als Teil der „omics“-Kaskade (s. Bild 1) zu verstehen. Bei dieser Art der Analytik werden möglichst alle Metaboliten gemessen, ohne eine vorherige Datendiskriminierung durchzuführen. Die Gesamtheit der Stoffwechselprodukte wird qualitativ und ausgewählte Metaboliten werden quantitativ erfasst, um regulatorische Prozesse und Effekte zu identifizieren. Die Veränderungen im Metabolom liefern Einblicke in zugrundeliegende biochemische Prozesse.

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Ein Ziel des FoCus-Projekts war es, Milchbestandteile zu funktionalisieren, um damit z. B. anti-inflammatorische Eigenschaften zu erzielen. Mit dem Metabolomics-Ansatz soll die Wirkung dieser funktionellen Lebensmittelkomponenten umfassend auf der Ebene des Metaboloms vom gesamten Organismus abgebildet werden.

Geräteplattform

Im Rahmen des FoCus-Projekts wurden zwei Massenspektrometer für den Einsatz im Bereich der Metabolomics eingesetzt: ein Quadrupol-Flugzeitmassenspektrometer (QToF), das an eine UHPLC gekoppelt ist, und ein Fourier-Transformation-Ionencyclotronresonanz-Massenspektrometer (FT-ICR-MS; Bild 2). Mit Hilfe der FT-ICR-MS können Proben im Hochdurchsatzverfahren (ohne vorherige chromatographische Trennung) gemessen werden. Massenpeaks werden mit einer Präzision von bis zu fünf Nachkommastellen genau gemessen bei einer durchschnittlichen Auflösung von ca. 800 000. Dies ermöglicht die Detektion der Isotopenfeinstruktur. Basierend auf der Präzision können Substanzen mit einem Fehler von < 1 ppm identifiziert werden. Mit Hilfe von verschiedenen Fragmentierungstechniken lassen sich Strukturaussagen treffen.

Bild 2: Die Kieler Metabolomics-Plattform, die aus dem FoCus-Projekt entstanden ist und mittlerweile für unterschiedlichste Anwendungen und Projekte genutzt wird. © Bilder: [3] – [6] , Uni Kiel

Die QToF besitzt eine Genauigkeit von ca. 30 ppm und eine Auflösung von 10 000. Aufgrund der hohen Detektionsrate (> 4 Messungen pro Sekunde) kann die Anlage mit einer UHPLC gekoppelt werden. Dies erlaubt den Einsatz von diversen chromatographiebasierten Fragmentierungstechniken, wie die Breitbandfragmentierung, und ermöglicht eine Ergebnisvalidierung basierend auf der Retentionszeit und den Fragmentmustern [1].

Für die Probenaufarbeitung wurden verschiedene Protokolle entwickelt und validiert, so dass eine Vielzahl von unterschiedlichen Matrices analysiert werden können. Am häufigsten wird dabei die probenoptimierte Flüssig-Flüssig-Extraktion (basierend auf Methyl-tert-butylether, Methanol und Wasser, „Simplex“) eingesetzt. Dies ermöglicht eine simultane Extraktion der lipophilen Metaboliten, z. B. Fettsäuren, und hydrophilen Metaboliten, z. B. organische Säuren und Zucker. Neben der analytischen Ausstattung wurde eine computergestützte Auswerteplattform initiiert, die einen großen Datenspeicherpool bietet und verschiedene Auswerteverfahren ermöglicht.

Datenauswertung

Für die Datenauswertung der massenspektrometrischen Analysen werden drei grundlegende Ansätze unterteilt: der gezielte (targeted), der erwartete-gezielte (semi-targeted) und der ungezielte (non-targeted) Ansatz. Alle drei Ansätze beruhen auf Metabolomics-Grundprinzipien: Die Probenaufarbeitung erfolgt ohne diskriminierende Ansätze, und es wird möglichst alles erfasst und gemessen. Bei dem gezielten Ansatz wird die Matrixbelastung reduziert, um bestimmte Substanzen optimal zu messen und zu quantifizieren. Bei dem erwarteten-gezielten Ansatz werden die Proben ungezielt gemessen (minimale Probenaufarbeitung zur Matrixreduzierung), um möglichst alle Metaboliten zu messen. Bei der Datenauswertung werden die gemessenen Massen mit erwarteten Massen verglichen. Die Auswertung erfolgt mittels Daten-Datenbankabgleich: Vorteil ist, dass große Datenmengen schnell qualitativ ausgewertet werden können.

Je nach Fragestellung stehen verschiedene Datenbanken zur Verfügung, angepasst an das jeweilige Projekt (z. B. basierend auf speziellen Stoffwechselwegen; insgesamt können > 6 000 verschiedene Metaboliten qualitativ gemessen werden). Der Abgleich erfolgt primär über zwei Parameter: die Massenabweichung (der Massenfehler zwischen der gemessenen und der berechneten Masse) und das Isotopenmuster. Je genauer ein System misst, desto besser können Isotopenpeaks differenziert werden. Bei einer Auflösung von ca. 10 000 werden Isotopenpeaks nur als „Gesamtpeak“ (ein Peak für alle Isotope) gemessen. Bei einer Auflösung > 500 000 lassen sich dagegen die einzelnen Isotope (z. B. Kohlenstoff und Stickstoff) differenziert messen – dies nennt man Isotopenfeinstruktur. Als Parameter wird das Verhältnis der gemessenen Isotopenfeinstruktur und der theoretischen Struktur genutzt. Dies ermöglicht eine verbesserte Validierung.

Darüber hinaus stehen noch weitere Möglichkeiten der Ergebnisvalidierung zur Verfügung. Diese wurden von Kind und Fiehn als die „Sieben goldenen Regeln“ (engl.: Seven Golden Rules) zusammengefasst und kombinieren z. B. die Verteilungswahrscheinlichkeiten von Sauerstoff zu Kohlenstoff, die Elektronenkonfigurationsregeln und die maximale Anzahl an Elementatomen [2]. Mit Hilfe der verschiedenen heuristischen Algorithmen können bei dem erwarteten, gezielten Ansatz die falsch positiven Treffer deutlich reduziert werden.

Bild 3: Abbildungsbeispiel für das Ergebnis einer Hauptkomponentenanalyse; auf der linken Seite ist der Score-Plot zu sehen (jeder Punkt steht für eine Messung, die Einfärbung ist rein zur Visualisierung von Clustern); auf der rechten Seite ist der Loadings-Plot zu sehen, dabei steht jeder Punkt für einen Metaboliten in der Gesamtmessung. © Uni Kiel

Der ungezielte Ansatz umfasst die statistische Modellierung der gemessenen Daten. Dafür werden zwei Verfahren unterschieden: die strukturentdeckenden und die strukturprüfenden Verfahren. Die Hauptkomponentenanalyse (engl. Principal Component Analysis, PCA) ist eines der wichtigsten strukturentdeckenden Verfahren. Die PCA wird auf einer n*m-dimensionalen Ergebnismatrix aller Metaboliten berechnet und transformiert diese in ein 2D- bzw. 3D-Modell bei einer gleichzeitigen Datenreduktion (ohne, dass Ergebnisse verloren gehen). Als Ergebnis der Hauptkomponentenanalyse wird der Score- und Loadings-Plot (Bild 3) genutzt. Im Score-Plot steht jeder Punkt für eine Analyse und dient somit der Strukturentdeckung. Gemeinsamkeiten oder Unterschiede werden über die Punkteverteilung sichtbar gemacht. Im Loadings-Plot steht jeder Punkt für einen gemessenen Metaboliten aus allen Proben. Je weiter die Metaboliten vom Ursprung entfernt liegen, desto höher ist die Varianz und desto größer ist auch der spezifische Informationsgehalt. Idealerweise liegen Metaboliten, die potenzielle Biomarker darstellen, in den Randbereichen um die restlichen Metaboliten. Diese werden als Housekeeping Metaboliten bezeichnet. Außerdem korrelieren beide Plots: Metaboliten, welche im Loadings-Plot rechts angeordnet sind, beeinflussen die Proben im Score-Plot auf der rechten Seite stärker.

Bei strukturprüfenden Verfahren werden Informationen zu den Proben, wie z. B. der Gesundheitsstatus, für die Algorithmen verwendet. Unterschiede und Gemeinsamkeiten werden erkannt und der jeweiligen Gruppe (z. B. Gesundheitsstatus) zugeordnet, so dass ein charakteristisches Metabolitenspektrum für jede Gruppe entsteht. So können unbekannte Proben, basierend auf dem Metabolitenspektrum, einer Gruppen zugeordnet werden.

Als Ergebnissynthese wird das Zusammenbringen der Daten aus den semi-gezielten und ungezielten Ansätzen betrachtet. Dabei wird versucht, die unterschiedlichen Ergebnisse in einen Kontext zu bringen und basierend darauf Stoffwechselwege zu beschreiben und mögliche Krankheitsbilder abzuleiten bzw. einzelne Biomarker zu identifizieren.

Fazit

Der Einsatz von verschiedenen massenspektrometrischen Methoden und Auswerteverfahren ermöglicht ein umfassendes Bild und ergänzt die klinische Phäno- und Genotypisierung. Die Metabolomics-Daten der Kieler FoCus-Kohorte stehen als Basisinformationen für weitere Projekte zur Verfügung. Es können verschiedene klinische Krankheitsbilder mit den Metabolomspektren der FoCus-Kohorte korreliert werden.

Zurzeit werden charakteristische Metaboliten aus mikrobiellen Abbauprozessen von sekundären Pflanzenstoffen analysiert und in die Metabolomics-Datenbank der FoCus-Kohorte integriert, um Prognosen zur Zusammensetzung der humanen Mikrobiota treffen zu können. Im Rahmen der neuen Exzellenzcluster in Kiel werden zukünftig auf der Metabolomics-Plattform auch Zahn-, Zahnstein-, Biopsie (z. B. Tumorschnitte)- und Haaranalysen ausgewertet.

AUTOREN

Dr. Tobias J. Demetrowitsch1, 2
M. Sc. Eva-Maria Theismann1
Prof. Dr. Karin Schwarz1, 2

1Institut für Humanernährung und Lebensmittelkunde, Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
2Netzwerk für analytische Spektroskopie und Massenspektrometrie, Christian-Albrechts-Universität zu Kiel

Literaturverzeichnis:

  1. Demetrowitsch, B. Petersen, J.K. Keppler, A. Koch, S. Schreiber, M. Laudes, K. Schwarz, Validation of a two-step quality control approach for a large-scale human urine metabolomic study conducted in seven experimental batches with LC/QTOF-MS, Bioanalysis 7 (2015) 103–112.
  2. Kind, O. Fiehn, Seven Golden Rules for heuristic filtering of molecular formulas obtained by accurate mass spectrometry, BMC bioinformatics 8 (2007) 105.
  3. What are we eating? https://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/Separations_MassSpectrometry/Literature/ApplicationNotes/LCMS-116_What_are_we_eating_eBook.pdf .
  4. Benton, J. Ivanisevic, N.G. Mahieu, M.E. Kurczy, C.H. Johnson, L. Franco, D. Rinehart, E. Valentine, H. Gowda, B.K. Ubhi, R. Tautenhahn, A. Gieschen, M.W. Fields, G.J. Patti, G. Siuzdak, Autonomous metabolomics for rapid metabolite identification in global profiling, Analytical chemistry 87 (2015) 884–891.
  5. Wishart, Y.D. Feunang, A. Marcu, A.C. Guo, K. Liang, R. Vázquez-Fresno, T. Sajed, D. Johnson, C. Li, N. Karu, Z. Sayeeda, E. Lo, N. Assempour, M. Berjanskii, S. Singhal, D. Arndt, Y. Liang, H. Badran, J. Grant, A. Serra-Cayuela, Y. Liu, R. Mandal, V. Neveu, A. Pon, C. Knox, M. Wilson, C. Manach, A. Scalbert, HMDB 4.0: The human metabolome database for 2018, Nucleic acids research 46 (2018) D608-D617.
  6. Kanehisa, M. Furumichi, M. Tanabe, Y. Sato, K. Morishima, KEGG: New perspectives on genomes, pathways, diseases and drugs, Nucleic acids research 45 (2017) D353-D361.
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