Mikrochip-Elektrophorese-Gerät "MCE 202 MultiNA"

Haar in der Suppe?

Mikrochip-Elektrophorese
Bild 2: Wiederverwendbarer Mikrochip aus Quarz.


Üblicherweise werden Kontaminationen, etwa in Lebensmitteln, mit Hilfe mikroskopischer Untersuchungen festgestellt. Besonders bei Verunreinigungen durch Tierhaare sind viel Erfahrung und spezielles Wissen der Mitarbeiter erforderlich. Eine zuverlässige, schnelle Alternative ist die Identifizierung der Tierarten durch Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und anschließende Analyse durch Mikrochip-Elektrophorese.


Die Produktion von Nahrungsmitteln, Medikamenten, Kosmetika, etc. stellt höchste hygienische Anforderungen an die Reinheit der produzierten Güter. Es gilt, Verunreinigungen aller Art auszuschließen. Sollte trotz aller Vorsichtsmaßnahmen dennoch einmal eine Kontamination auftauchen, ist es notwendig, schnell und zuverlässig die Quelle ausfindig zu machen und genau zu identifizieren. Nur so kann eine Standardvorgehensweise entwickelt werden, um zukünftig weitere Vorfalle zu verhindern.

Die PCR-Technik ermöglicht die schnelle Vervielfältigung doppelsträngiger DNA. Durch den Einsatz spezifischer Primer ist es möglich, DNA-Fragmente zu synthetisieren, die zum Beispiel für unterschiedliche Tierarten spezifisch sind. Die Analyse und Zuordnung dieser Fragmente erfolgt an Hand ihrer Größe. Konventionell wird im Anschluss an die PCR die Agarose-Gel-elektrophorese verwendet, um die Größe der DNA-Fragmente zu bestimmen. Hierbei wird eine elektrische Spannung an das Agarose-Gel angelegt, wodurch die negativ geladene DNA durch die Agarose wandert. Diese bildet eine netzartige Matrix, in der die DNA-Fragmente proportional zu ihrer Größe aufgetrennt werden. Anschließend färbt man sie mit einem Fluoreszenzfarbstoff an (üblicherweise Ethidiumbromid [EtBr]) und macht sie durch Bestrahlung mit UV-Licht sichtbar.

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Automatisierte Mikrochip-Methode

Eine moderne Alternative zur klassischen Agarose-Gelelektrophorese ist das automatisierte Mikrochip-Elektrophorese-Gerät „MCE-202 MultiNA“ von Shimadzu (Bild 1). Hierzu erfolgt die Größenbestimmung von DNA-Fragmenten sowie deren Quantifizierung mit einer Mikrochip-Technologie. Die wiederverwendbaren Quarz-Mikrochips (Bild 2) haben einen 23 mm langen Trennkanal, in dem die DNA-Fragmente in einem Polymer-Trennpuffer aufgetrennt werden. Das Befüllen der Mikrochips mit Trennpuffer und Probe, die Elektrophorese, sowie das anschließende Spülen laufen vollautomatisiert ab.

Insgesamt können bis zu vier Mikrochips im Gerat installiert werden. Der verschachtelte Arbeitsablauf bei gleichzeitiger Verwendung mehrerer Mikrochips (Spülen, Beladen, Elektrophorese) ermöglicht eine Senkung der Analysedauer auf bis zu 75 s je Probe. Pro Lauf können bis zu 120 Proben in einem Analysenplan registriert werden.

Als Probengefäße eignen sich neben 96-Well-Platten auch 8- oder 12-Strip-Tubes oder Einzeltubes. Für jeden Mikrochip wird eine Größenkalibrierkurve mit einer beliebig auswählbaren DNA-Leiter aufgenommen, an Hand derer die Fragmentgrößen in den Proben akkurat bestimmt werden können. Um produktionsbedingte geringe Varianzen zwischen den verschiedenen Mikrochips auszugleichen, wird jeder Analyse ein internes Markersystem (unterer und oberer Marker) automatisch von dem Gerat zu der zu analysierenden Probe hinzugefügt. Der untere und der obere Marker begrenzen dabei den Größenbereich, der analysiert werden kann.
Der analysierbare Größenbereich wird neben dem internen Markersystem auch durch den verwendeten Trennpuffer bestimmt. Trennpuffer und interne Marker werden gemeinsam als Reagenzien-Kit vertrieben. Aktuell wird durch die Wahl eines der vier Reagenzien-Kits für doppelsträngige DNA der Größenbereich von 25...12000 bp und mit dem RNA-Kit bis 5 knt abgedeckt (Bild 3).

Vorteile der automatisierten Methode

Die automatisierte Mikrochip-Elektrophorese bietet gegenuber der klassischen Gelelektrophorese zahlreiche Vorteile:

  • Hohe Sensitivität – der verwendete Fluoreszenzfarbstoff und das optische Detektionssystem sind bis zu zehnmal empfindlicher als die klassische Ethidiumbromid-Färbung.
  • Schnelle Vollautomatisierung – durch Staffelung von insgesamt vier Mikrochips kann die Analysendauer auf 75 s/Probe reduziert werden.
  • Hohe Reproduzierbarkeit u.a. auf Grund der geringen Anzahl manueller Schritte und der damit verbundenen Reduktion von Fehlerquellen.
  • Einfache Handhabung durch eine anwenderfreundliche, gut durchdachte Software.
  • Niedrige laufende Kosten durch vielfach wiederverwendbare Mikrochips.

Kombiniert man nun einen PCR-basierten Nachweis mit der anschließenden Detektion auf der MultiNA, hat man eine automatisierte, schnelle und zuverlässige Methode zum Nachweis der Kontamination durch Tierhaare. Auf diese Weise wurden Haare von sechs verschiedenen Nutztieren (Kuh, Schwein, Huhn, Pferd, Schaf und Ziege), drei Haustierarten (Hund, Katze und Kaninchen) sowie drei Nagetieren (Kanalratte, Hausratte und Hausmaus) eindeutig identifizier (Bild 4). Hierzu wurde die DNA der entsprechenden Tiere aus Tierhaaren extrahiert und zur PCR-Analyse eingesetzt. Für jede Spezies wurden spezifische Primersets verwendet, die PCR-Fragmente von spezifischer Größe für jedes Tier hervorriefen.

Im Anschluss an die PCR erfolgte die Größenbestimmung der PCR-Produkte mit Hilfe der MultiNA.

Fazit

Mit der hier vorgestellten Methode ist es möglich, aufgetretene Kontaminationen nicht nur zu entdecken, sondern eindeutig zuzuordnen und so die Quelle (zum Beispiel Nutz- oder Haustier) schnell zu finden. Nur so lässt sich gewährleisten, dass die Quelle der Kontamination sicher ausgeschlossen werden kann und in Zukunft niemand mehr ein Haar in der Suppe, dem Schmerzmittel oder der Hautcreme findet.

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