Gluten-Nachweis

Glutenfrei - Wie erbringt man den Nachweis?

Elisabeth Hammer*)

Die Gesundheit von Zöliakiepatienten hängt von der korrekten Kennzeichnung glutenfreier Nahrungsmittel ab. Die Sicherheit von Lebensmitteln zu garantieren, ist eine besonders fordernde Aufgabe, und deshalb werden kontinuierlich neue Verfahren zum Nachweis von Gluten entwickelt. Die Resultate, welche aus den auf Basis des G12-Antikörpers entwickelten, neuen immunchemischen Testsystemen gewonnen werden können, kommen dem Ideal eines Tests für die Lebensmittelsicherheit sehr nahe, da sie einen wichtigen Zusammenhang zwischen Zöliakie und dem Nachweis immuntoxischer Peptide herstellen.

Während der letzten zehn Jahre stieg die Nachfrage nach glutenfreien Lebensmitteln stark an, was dazu führte, dass immer mehr solcher Produkte in den Regalen zu finden sind. Obwohl die Empfindlichkeit gegenüber Gluten bei Personen, die Schwierigkeiten bei der Verdauung von Gluten haben, unterschiedlich stark ausgeprägt ist, zeigt sich, dass eine glutenfreie Ernährung generell zu einer Verbesserung der Situation führt. Zudem setzt sich bei einer immer größeren Anzahl an Verbrauchern die Auffassung durch, dass eine glutenfreie Ernährung gesünder ist. Doch was ist eigentlich Gluten? Warum kann Gluten toxisch sein? Und wie kann Gluten in Lebensmitteln nachgewiesen werden?

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Was ist Gluten?

Der Name „Gluten“ leitet sich vom lateinischen Wort für Leim bzw. Klebstoff ab und steht für ein Stoffgemisch aus Prolaminen und Glutelinen, beides Proteine, die in Weizen, Gerste, Roggen, Hafer und in den daraus gezüchteten Kreuzungen vorkommen. Prolamine werden als die Fraktion definiert, die sich in einer 40...70 % Ethanollösung extrahieren lässt und je nach Getreideart als Gliadin, Hordein, Secalin oder auch Avenin bezeichnet wird. Generell kann man grob abschätzen, dass Prolamine und Gluteline im selben Verhältnis in Gluten vorkommen.

Weltweit ist Gluten eine wichtige Proteinquelle, sowohl in Nahrungsmitteln, die direkt aus glutenhaltigen Rohstoffen hergestellt werden, als auch als Zusatz in Lebensmitteln, die selbst nur wenig Eiweiß enthalten. Aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften verleiht Gluten Lebensmitteln eine gewisse Konsistenz und Form. Wird Gluten mit Wasser vermengt und gut durchgeknetet, formt es einen viskoelastischen Teig mit einem speziellen Proteinnetzwerk, das Backwaren ihre Form gibt.

Zöliakie

Nach dem Übergang vom Jäger- und Sammler-Dasein zu den Anfängen der Landwirtschaft vor etwa 10 000 Jahren entwickelten sich Getreideprodukte zu einer der Grundsäulen der menschlichen Ernährung. Es stellt sich jedoch die Frage, warum Gluten heute immer mehr gesundheitliche Probleme bereitet. Etwa 1 % der Weltbevölkerung leidet an Zöliakie – eine immunologisch vermittelte Enteropathie, welche durch die Aufnahme von Gluten verursacht wird. Interessanterweise sind Frauen häufiger von dieser Krankheit betroffen als Männer. Die Symptome sind jedoch sehr unterschiedlich und beschränken sich nicht nur auf den gastrointestinalen Trakt. So treten nicht nur Symptome wie etwa Durchfall, Bauchschmerzen, Flatulenz, Verdauungsprobleme und Gewichtsverlust auf, sondern auch Gereiztheit, Depressionen und Angstzustände. Alle diese Anzeichen sind jedoch keine zuverlässigen Indikatoren für diese Krankheit.

Eine Möglichkeit, Zöliakie zu diagnostizieren, ist der Nachweis bestimmter Antikörper im Blut. Eine andere empfohlene Methode ist die Durchführung einer Biopsie an Schleimhaut und Dünndarm, um eventuelle Schäden festzustellen, da die Krankheit mikroskopisch kleine, fingerartige Erhebungen im Dünndarm – sogenannte Villi oder auch Darmzotten – zerstört. Da diese Darmzotten aber Nährstoffe absorbieren, führt die Zerstörung zu einer Mangelernährung, die längerfristig Probleme wie beispielsweise verzögertes Wachstum, Osteoporose oder Nährstoffmängel verursachen kann.
Zöliakie ist eine genetisch bedingte Autoimmunerkrankung, bei der das Immunsystem mit einer Überreaktion auf Gluten in der Nahrung reagiert. Das Enzym Gewebe-Transglutaminase modifiziert Glutenpeptide mittels Deamidierung so, dass T-Zell-Epitope gebildet werden. Dies stimuliert das Immunsystem und reagiert mit dem Dünndarmgewebe, was zu einer Entzündung und Verstümmelung der Villi führt. Solch eine Immunreaktion wird überwiegend durch Prolamine ausgelöst. Die stärkste Reaktion richtet sich gegen ein α2-Gliadin-Fragment, welches 33 Aminosäuren lang ist und einer der hauptverantwortlichen Auslöser für Glutenimmuntoxizität ist. Dieses sogenannte 33-mer ist hochresistent gegenüber dem Abbau durch Verdauungsenzyme, was dieses Molekül wiederum zu einem geeigneten Analysemarker macht. Homologen wurden auch in für Zöliakiepatienten toxischen Getreidesorten gefunden, jedoch nicht in nicht-toxischem Getreide.

Bis dato ist die einzig effektive Behandlung von Zöliakie eine lebenslange glutenfreie Diät. Aufgrund des häufigen Vorkommens von Gluten in Nahrungsmitteln ist dies aber alles andere als leicht. Oft findet sich „verstecktes“ Gluten als Proteinbeigabe in harmlos erscheinenden Produkten, wie etwa Medikamente, Wurst, Saucen und Desserts. Zudem können glutenfreie Produkte auch Gluten aufgrund von Kontamination während des Mahlens, Lagerns oder der Herstellung enthalten.

Glutenfreie Lebensmittel basieren normalerweise auf Reis, Mais oder Buchweizen sowie auf gereinigter Stärke, die trotzdem noch geringe Mengen an Gluten aufweist. Aufgrund der von Person zu Person unterschiedlichen Ausprägung ist es sehr schwer, genaue Grenzwerte zu bestimmen. Laut wissenschaftlichen Studien sollten dem Körper nicht mehr als 50 mg Gluten pro Tag zugeführt werden.

Gesetzgebung und Richtwerte

Die Codex Alimentarius Kommission begann Ende der 1970er Jahre, Empfehlungen für Grenzwerte zu diskutieren, was schließlich zur Veröffentlichung des 2008 CODEX Standard für diätetische Lebensmittel für Personen mit Glutenunverträglichkeit (CODEX STAN 118 – 1979) führte. Diese Empfehlung wurde per Verordnung (EC) No 41/2009 vom 20. Januar 2009 in die europäische Gesetzgebung aufgenommen und betrifft die Zusammensetzung und Kennzeichnung von Lebensmitteln, die für Menschen mit einer Glutenunverträglichkeit geeignet sind. Im Gegensatz zu anderen Lebensmittelallergenen wurden dabei Schwellenwerte definiert. Als glutenfrei gekennzeichnete Nahrungsmittel dürfen dabei einen Wert von 20 ppm nicht überschreiten, wohingegen Lebensmittel mit geringen Mengen an Gluten unter einem Wert von 100 ppm liegen müssen. In den USA ist gerade ein Vorschlag zu einer Regelung für die Kennzeichnung glutenfreier Lebensmittel in Arbeit.


Analyse von Gluten

Damit die bestehenden Vorschriften auch eingehalten werden können, braucht es entsprechende Untersuchungsmethoden, um Gluten in der Nahrung nachzuweisen. Dafür gibt es mehrere Verfahren, die sowohl qualitative als auch quantitative Ergebnisse liefern, wie etwa spezifische Tests, basierend auf Antikörpern z.B. Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) oder Lateral Flow Assays, Polymerase-Kettenreaktion-(PCR-)Verfahren sowie neuere Konzepte wie die Massenspektroskopie – die allesamt einen unterschiedlichen Grad an Marktreife aufweisen. Dabei sollte ein analytisches Nachweisverfahren, wenn möglich, in der Lage sein, Epitopen, die bei Zöliakie eine Rolle spielen, nachzuweisen.

Die Tatsache, dass Gluten eine komplexe Mischung aus Proteinen ist und in einer großen Bandbreite von sowohl unverarbeiteten als auch verarbeiteten Lebensmitteln vorkommt, stellt eine große Herausforderung bei der korrekten Quantifizierung dar und macht es auch sehr schwierig, geeignetes Referenzmaterial zu finden. Im Jahre 1985 wurde die Prolamin Working Group (PWG) in Europa gegründet. Zu ihren Aufgaben gehörte auch die Herstellung eines anerkannten Gluten- beziehungsweise Gliadinstandards. Mit dem Extrahieren von Gliadinen aus einer Auswahl der gängigsten Weizensorten gelang es, ein Referenzmaterial herzustellen. Das IRMM (Institute for Reference Material and Measurements) akzeptierte anfangs das PWG-Gliadin als zugelassenes Referenzmaterial, widerrief diese Entscheidung jedoch später. Allerdings ist das PWG-Gliadin bis heute das einzige Referenzmaterial, das zumindest eine gewisse Anerkennung findet und auch häufig bei der Kalibrierung von Testverfahren eingesetzt wird.

Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA-Verfahren) sind die gebräuchlichsten Nachweismethoden von Gluten in Nahrungsmitteln. Dafür sind die unterschiedlichsten Test-Kits am Markt erhältlich. Bei immunologischen Verfahren werden Antikörper verwendet, die gegen verschiedene Prolaminfraktionen oder spezifische toxische Sequenzen gerichtet sind. Verschiedene Test-Kits müssen aber nicht unbedingt zum gleichen Ergebnis kommen. Dafür gibt es mehrere Gründe – unter anderem die Spezifität der verwendeten polyklonalen und monoklonalen Antikörper, verschiedene Extraktionsmethoden, sowie der Einsatz unterschiedlicher Materialien bei der Kalibrierung der Verfahren.
Zum Nachweis von Gluten wurden eine Vielzahl monoklonaler und polyklonaler Antikörper entwickelt, von denen aber nur einige wenige von einer breiteren Basis anerkannt sind. Ende der 1980er Jahre wurde der Skerritt-Antikörper entwickelt. Dieser monoklonle Antikörper wurde mittels Weizengliadin einer australischen Weizenart entwickelt und erkennt HMW-(High Molecular Weight-)Glutenin-Untergruppen und die hitzeresistente Unterfraktion der ω-Gliadine, weswegen er sich zur Bestimmung von Gluten in verarbeiteten Lebensmitteln eignet. Da jedoch die Quantifizierung auf der Menge der ω-Gliadine basiert und die-se sich je nach Getreidesorte unterscheidet, kann dies zu stark voneinander abweichenden Resultaten führen. Außerdem reagiert der Skerritt-Antikörper nur sehr schwach auf Hordein.

Ein weiterer monoklonaler Antikörper zum Nachweis von Gluten ist der R5-Antikörper, entwickelt von Professor Mendez in Spanien. Der R5-Antikörper ist gegen Secalin (Roggen) gerichtet und zeigt auch eine starke Reaktion auf Gliadin (Weizen). Allerdings reagiert er auch auf Soja- und Lupinen-Proteine, die keine schädlichen Prolamine sind.

Ein neuer Ansatz, immuntoxische Peptide, welche eine Rolle bei der Pathogenese von Zöliakie spielen, nachzuweisen, anstatt des Nachweises von Prolaminen, führte zur Entwicklung einer nächsten Generation von Antikörpern. So gehört zum Beispiel der G12-Antikörper, der bei AgraQuant® Gluten G12 ELISA und AgraStrip® Gluten G12 Lateral Flow Test verwendet wird, zu dieser nächsten Generation.

Die nächste Generation der Glutenanalyse

Der G12-Antikörper erkennt das 33-mer des Gliadinproteins (Weizen), welches in Gluten vorkommt. Dieses toxische Fragment wurde an der Stanford Universität identifiziert und 2002 in einem Beitrag im Wissenschaftsmagazin Science vorgestellt. Der G12-Antikörper wurde unter Anwendung der aus dieser Publikation gewonnenen Erkenntnis gegen dieses 33-mer Peptid gerichtet und erkennt die Hexapeptidsequenz QPQLPY sowie ähnliche Peptide, die in Gerste, Roggen und Hafer vorkommen. Im Gegensatz dazu wurde der R5-Antikörper zuerst gegen Secalin gerichtet und danach das damit reagierende Epitop als QQPFP-Pentapeptid identifiziert. Die Unterscheidung zwischen diesen beiden Antikörpern liegt darin, dass der G12-Antikörper direkt auf das toxische Fragment, welches die Autoimmunreaktion bei Zöliakiepatienten auslöst, abzielt und nicht nur auf eine Peptidsequenz, die nichts mit klinischen Ergebnissen zu tun hat. Während der Validierungsstudien konnte bestätigt werden, dass G12 keine positive Reaktion bei Soja aufweist und sich deshalb für die Messung des Gluten-anteils in sojahältigen Produkten eignet. Zudem zeigte sich auch keine Reaktion mit Mais und Reis.

Es gibt endlose Diskussionen darüber, ob Hafer für Zöliakiepatienten sicher ist oder nicht. Einige Publikationen kommen zu dem Schluss, dass bestimmte Haferarten Autoimmunreaktionen bei Zöliakiepatienten hervorrufen können. Im Zuge der Validierung des AgraQuant® Gluten G12 ELISA Tests und AgraStrip® Gluten G12 Lateral Flow Tests konnten sowohl positive als auch negative Reaktionen bei verschiedenen Hafersorten beobachtet werden. Die positiven Resultate scheinen eher eine spezifische Reaktion des Antikörpers mit dem toxischen Fragment zu sein und weniger eine unbestimmte Reaktion. Deshalb könnte der G12-Antikörper neues Licht in diese Debatte bringen, indem diejenigen Haferarten identifiziert werden können, die eine Reaktion bei Zöliakiepatienen auslösen. Vor Kurzem vergab der spanische Zöliakieverband den 6. nationalen Preis für die Erforschung von Zöliakie an eine Gruppe von Wissenschaftlern, die den G12-Antikörper dazu nutzte, Haferarten mit geringen Mengen an Gluten zu identifizieren.

Literatur

Structural Basis for Gluten Intolerance in Celiac Sprue. Shan L., Molbergv Ø., Parrot I., Hausch F., Filiz F., Gray G.M., Sollid L.M., Khosla C., Science. 2002 Sep 27;297(5590):2275-9.

Toward the Assessment of Food Toxicity for Celiac Patients: Characterization of Monoclonal Antibodies to a Main Immunogenic Gluten Peptide. Morón B., Bethune M.T., Comino I., Manyani H., Ferragud M., López, M.C., Cebolla A., Khosla C., Sousa C., PLoS ONE. 2008 May 28;3(5):e2294.

Sensitive detection of cereal fractions that are toxic to celiac disease patients by using monoclonal antibodies to a main immunogenic wheat peptide. Morón B., Cebolla A., Manyani H., Alvarez-Maqueda M., Megías M., Del Carmen Thomas M., López M.C., Sousa C., Am J Clin Nutr. 2008 Feb;87(2):405-14.

The Molecular Basis for Oat Intolerance in Patients with Celiac Disease. Arentz-Hansen H., Fleckenstein B., Molberg Ø., Scott H., Koning F., Jung G., Roepstorff P., Lundin K.E.A., Sollid L.M., PLoS Medicine, 2004 – http://medicine.plosjournals.org

*) Elisabeth Hammer

  1. Product Manager Romer Labs Division Holding GmbH, A-3430 Tulln, Technopark 1, Tel. +43 2272 61533, E-Mail: office-europe@romerlabs.com
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