Der Schlüssel zur effektiven Kultur
Die größere Rolle der Zellkulturforschung für die Entwicklung von Therapeutika und Impfstoffen bringt auch eine größere Verantwortung mit sich.
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Inkubator-Serie Die Thermo Scientific Heratherm

Thermische Dekontamination

Der Schlüssel zur effektiven Kultur
Bild 3: Inkubator-Display mit Anzeige des Dekontaminationszyklus.

B. Eng. Verena Ruckstuhl*)

  1. Thermo Fisher Scientific, E-Mail: verena.ruckstuhl@thermofisher.com
Die größere Rolle der Zellkulturforschung für die Entwicklung von Therapeutika und Impfstoffen bringt auch eine größere Verantwortung mit sich. Laboratorien in Pharmazeutik, Medizin, Nahrungsmittelindustrie und Forschung müssen Inkubationsverfahren mit bewährten und zuverlässigen Dekontaminationsmethoden einsetzen.


Bei der Zell-Kultivierung mit verschiedenen Organismen (wie Bakterien, Hefen oder Pilzen) bis zur späteren Verwendung spielt die Vermeidung potenziell kontaminierender Mikroorganismen aus dem Inkubationsumfeld eine wichtige Rolle. Falls Kulturen von Mikroorganismen befallen oder mit Fremdzellen kreuzkontaminiert werden, wird die Lebensfähigkeit dieser Kulturen erheblich beeinträchtigt.

Um negative Auswirkungen auf nachfolgende Versuchsphasen und Daten zu vermeiden, werden kontaminierte Kulturen im Allgemeinen vernichtet. Dies ist zeitaufwendig und kostet Geld, da die gesamte Vorbereitungs- und Kultivierungsphase unter Verwendung neuer Organismen und Reagenzien wiederholt werden muss. Kontaminationsursachen sind schwierig zu identifizieren und können somit nicht vollständig eliminiert werden. Die größere Rolle der Zellkulturforschung für die Entwicklung von Therapeutika und Impfstoffen bringt auch eine größere Verantwortung mit sich. Laboratorien in Pharmazeutik, Medizin, Nahrungsmittelindustrie und Forschung müssen Inkubationsverfahren mit bewährten und zuverlässigen Dekontaminationsmethoden einsetzen.

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Mikrobiologische Inkubatoren

Mikrobiologische Inkubatoren wurden für den Einsatz im Labor entwickelt und gewährleisten optimale Bedingungen für die effektive Kultivierung pro- und/oder eukaryotischer Zellen. Sie bieten eine komplexe Temperaturregelung, die sicherstellt, dass sich Organismen vermehren sowie schnell und effizient wachsen. Mikrobiologische Brutschränke werden häufig von mehreren Personen gemeinsam genutzt. Bei unsachgemäßer Reinigung der Brutkammer hat die Kultur eines Anwenders durch Kreuzkontamination von Zellarten oftmals negative Auswirkungen auf die eines anderen Anwenders. Darüber hinaus können Mikroorganismen durch häufiges Öffnen der Inkubatortür, Kontakt mit Haut, Haar, Kleidung, oder aber aufgrund unsachgemäßer Reinigung in den Inkubator-Innenraum gelangen. Bakterien und Pilze (einschließlich Hefen und Schimmelpilzen) sind die am einfachsten zu erkennenden mikrobiellen Verunreinigungen. Sie sind auch überall im Laborumfeld zu finden und können sich rasant vermehren. Andere kontaminierende Mikroorganismen wie Mykoplasmen und Viren sind schwieriger zu identifizieren, richten jedoch oftmals erhebliche Schäden an Zellkulturen an und können unter Umständen sogar Personen infizieren. Daher muss der ideale mikrobiologische Inkubator ein wirksames Dekontaminationsverfahren besitzen, das potenziell nachteilige Verunreinigungen auch in geringen Konzentrationen aus dem Inkubationsumfeld entfernt. Dies schützt wertvolle Kulturen und wahrt ihre Integrität.

Ein unabhängiges Institut (Institut für Biotechnische Forschung und Entwicklung, Deutschland [1]) hat diesbezüglich den Thermo Scientific Heratherm Advanced Protocol Security Inkubator getestet. Dabei wurde der 140ºC-Dekontaminationszyklus mit trockener Hitze auf seine Wirksamkeit bei der Beseitigung einer Reihe von kontaminierenden Mikroorganismen geprüft.

Testmethoden

Um die Wirksamkeit des in den Inkubator integrierten thermischen 140°C-Dekontaminationszyklus zu testen, wurde eine Zellsuspension direkt einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) zugeführt, verdünnt und auf Trypton-Soja-Agar (TSA) aufgebracht, um die KBE-Gesamtanzahl der aufgebrachten Suspension zu ermitteln. So konnte die Wirksamkeit der Zellrückgewinnung von der Oberfläche nach dem Experiment bestimmt werden.

Um die Wirkung der Oberflächen auf die Zellinaktivierung zu überprüfen, wurden zwei Flächen des Inkubatorinnenraums (die unteren Edelstahlplatte und die Innenfläche der Glastür) gemäß Tabelle 1 kontaminiert.

  • Die Zellsuspensionen wurden 6 h lang bei 35 ºC auf den Oberflächen getrocknet.
  • Die Organismen wurden von den Oberflächen mit Hilfe steriler Wattestäbchen entfernt.
  • Nach Vortexen und Ultraschall-Behandlung wurden geeignete Verdünnungen auf TSA-Agar aufgebracht, und die koloniebildenden Einheiten (KBE) nach 24 und 48 h Inkubationszeit bestimmt.

Zur Prüfung der Wirksamkeit des Dekontaminationszyklus auf die Zellinaktivierung wurden 55 Bereiche des Innenraums (rechts, unten, oben, links, hinten, auf der Innenseite der Glastür, Glastür-Außenseite, Stahltür, Einschub 1, Einschub 2, Einschub 3) mit einer der in Tabelle 1 aufgeführten mikrobiellen Suspensionen kontaminiert. Die Kontaminationsstellen sind in Bild 1 dargestellt.

  • Das Dekontaminationsprogramm wurde bis zum Abschluss ausgeführt (sechs Stunden bei 140 °C)
  • Die Mikroorganismen wurden mit mikrobiologischen Nachweisplatten (RODAC-Verfahren zum Nachweis von Organismenreplikation und -bestimmung, TSA-Agar als Wachstumsmedium) rückgewonnen. Dieses Verfahren ist für den Nachweis niedriger KBE-Niveaus auf Oberflächen sehr viel empfindlicher als die Wattestäbchenmethode.
  • Nach einer Inkubationszeit von 24 und 48 h wurde die KBE-Anzahl bestimmt.

Zur Gewährleistung der Zuverlässigkeit gewonnener Daten wurde das gesamte Protokoll zweimal durchgeführt.

Testergebnisse

Die Studie konnte nachweisen, dass nach dem Ausführen eines thermischen Dekontaminationslaufes (6 h bei 140 ºC) keine Mikroorganismen von den künstlich kontaminierten Oberflächen rückgewonnen werden konnten. Dies zeigt, dass ein Inaktivierungsgrad von über 99,99999 % (> 7 log) auftrat. Der zweite Dekontaminationslauf der Studie ergab die gleichen Inaktivierungsgrade. Von keinem Oberflächenteil konnten lebensfähige Mikroorganismen rückgewonnen werden.

Der in der Studie eingesetzte vergleichende 6 h dauernde Trockenprozess bei 35 ºC hatte keine nennenswerte Auswirkungen auf Sporen (B. atrophaeus) und Konidiosporen (A. brasiliensis). Die KBE-Werte von P. aeruginosa und S. aureus wurden am deutlichsten beeinflusst, was ihrem Bedürfnis nach feuchten Umgebungsbedingungen entspricht. Die Inaktivierung lag jedoch unter 1 log und war im Vergleich zur oben nachgewiesenen Wirksamkeit des 140ºC-Dekontaminationslaufes vernachlässigbar klein.

Fazit

Dekontamination ist ein zentraler Bestandteil jedes Kultivierungsprotokolls, um Kontaminationen mit verschiedenen Mikroorganismen zu beseitigen. Durch die Integration eines wirksamen Dekontaminationslaufes, wie den 140ºC- Dekontaminationszyklus des Thermo Scientific Heratherm Advanced Protocol Security Inkubators in einem mikrobiologischen Inkubator, werden vorhandene potenziell kontaminierende Mikroorganismen wirksam inaktiviert. Diese Routine ist von einem akkreditierten mikrobiologischen Institut (IBFE Institut für Biotechnische Forschung und Entwicklung, Deutschland) zertifiziert und eliminiert die Notwendigkeit für separates Autoklavieren von Innenkomponenten, was Zeit für andere Versuchsprotokolle spart. Die Testergebnisse zeigen, dass der Dekontaminationszyklus die Integrität kultivierter Organismen gewährleistet und resultierende Daten zuverlässig, reproduzierbar und von höchster Qualität sind.

Referenzen

  1. Report 1420710-2a: Determination of the Efficiency of the Thermal Decontamination in a Microbiological Incubator (Heratherm IMH180-S/41112744). Dr. Heiko Ewen, IBFE Institut für Biotechnische Forschung und Entwicklung.
  2. Weitere Informationen finden Sie unter http://www.thermoscientific.com/incubators.
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