Life Sciences Innovations

Leistungsstarke Zellanalysen

Dieser Fachbeitrag dokumentiert neue Ansätze zur Überwachung des Zellzustandes, des Zellzyklus und der Apoptose, leistungsstarke Multiplex-Assays, die einen ganzheitlicheren Einblick in die Zelle ermöglichen und Immunfunktionsassays auf Basis einer innovativen Kombination aus Durchflusszytometrie und Bildgebung.

Morphologische Veränderungen, Wechselwirkungen mit anderen Zellen und der Umgebung, komplexe Signalwege und die Lokalisierung zellulärer Ereignisse sind nur einige wenige Beispiele für die Forschungsbereiche, die Wissenschaftler auf der Suche nach potenziellen Ansatzpunkten für die Entwicklung neuer Arzneimittel untersuchen. Unser Verständnis interner Abläufe in Zellen und zellulärer Wechselwirkungen vertieft sich rasch – unterstützt durch Technologien, welche die Datenerfassung erleichtern und komplexere Daten zu Zellpopulationen sowie zu einzelnen Zellen liefern. Diese Fortschritte basieren auf verschiedenen Innovationen: die Verbesserung jahrzehntealter manueller Methoden, miniaturisierte Technologien, Multiplex-Analysen und die Verbindung traditionell „eigenständiger“ Technologien zur Gewinnung tieferer Einblicke.

Fortschritte in der Beurteilung der Zellgesundheit

Die Zellzahlbestimmung ist ein essentieller Schritt bei der Aussaat und Passagierung von Zellen oder der Vorbereitung zellbasierter Assays. Die Zellzahl kann außerdem zur qualitativen Überprüfung der Zellkultur, von Proliferationsraten und zur Beurteilung der zellulären Immortalisierung für Transformationsexperimente herangezogen werden.

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Trotz der Notwendigkeit für Präzision und Schnelligkeit erfolgen die meisten Zellzahlbestimmungen immer noch manuell mit Hilfe eines Hämozytometers – einer Methode, die bereits im späten 19. Jahrhundert zur Quantifizierung von Blutkörperchen eingeführt wurde. Alternativ kann zur Zellzahlbestimmung auch auf Zählgeräte zurückgegriffen werden, wie zum Beispiel automatische Mikroskopie-basierte Zellzähler, Durchflusszytometer oder Systeme, die auf dem Coulter-Prinzip basieren. Diese Coulter-Technik, die um 1940 zur Zählung von Blutzellen entwickelt wurde, wird heute in den meisten automatischen Zellzählern eingesetzt.

Diese automatischen Zellzähler helfen dabei, die Problematik der Zählung mittels Hämozytometer zu umgehen. Aufgrund der hohen Kosten großer Tischgeräte ist aber oftmals eine Anschaffung für diesen Zweck nicht realisierbar.

Die neueste Innovation in der Zellzähltechnik kombiniert die einfache Handhabung automatischer Geräte und die Präzision der Coulter-Technik in einem tragbaren Gerät. Diese Technik ist dabei nicht nur eine Methode zur Zellzählung, sondern bietet darüber hinaus auch unmittelbaren Einblick in den Zustand einer Zellpopulation.
Der Scepter™ Zellzähler (Merck Millipore) verwendet das Coulter-Prinzip der impedanzbasierten Partikelerkennung in einem miniaturisierten Format. Das Gerät hat die Größe einer automatischen Pipette und verwendet eine Kombination aus analogen und digitalen Komponenten für die Zellerkennung, Signalverarbeitung, Datenspeicherung und grafische Anzeige. Die Einweg-Spitze verfügt über eine mikrogefertigte Detektionszone, die eine Unterscheidung nach Zellgröße mit einer Auflösung im Sub-Mikrometer-Bereich und nach Zellvolumen im Sub-Picoliter-Bereich ermöglicht.

Statistische Daten zur Zellpopulation werden in Histogrammform direkt auf dem Gerät angezeigt. Diese Daten können einen unmittelbaren Einblick in den Zustand von Zellpopulationen geben. Gut erhaltene Kulturen zeigen eine relativ hohe Anzahl von Zellen mit dem für sie spezifischen Zelldurchmesser.

Neben der automatischen Zellzählung kann diese Technik auch dazu verwendet werden, das Verständnis der molekularen Mechanismen zu vertiefen, die der Selbsterneuerung und Differenzierung embryonaler Stammzellen (ES) zugrunde liegen. Bild 1 zeigt ein Histogramm embryonaler Stammzellen, die auf einer Fibroblasten-Nährzellschicht gezogen wurden. Die divergenten Peaks werden dabei dazu verwendet, spezifische Populationen in einer einzigen Probe auszuzählen. Auch für klinisch relevante Zelltypen kann auf diese Weise die Differenzierung embryonaler Stammzellen überwacht und quantifiziert werden. Im Rahmen der Stammzell-Differenzierung zeigen sich signifikante Verschiebungen im Histogramm, welche die Erfassung nicht nur von Endpunktdaten, sondern dynamischer zeitlicher Veränderungen ermöglicht.

Bessere Leistung, kompakteres Format

Trotz aller Vorteile der Zytometrie für Multiparameter-Proteinstudien waren konventionelle Systeme aufgrund von Größe, Komplexität, Kosten und Wartungsanforderungen bisher überwiegend Experten in großen Laboren oder Zentrallaboren vorbehalten. Wissenschaftler, die Zugang zu Durchflusszytometern benötigten, mussten sich oftmals auf den Service eines Zentrallabors verlassen.

Wir sind heute dazu in der Lage, die Flüssigkeits- und Optikelemente für den Fluoreszenznachweis zu miniaturisieren (Muse™ Zellanalysegerät, Merck Millipore), um die Zytometrie auf den Labortisch von Wissenschaftlern zu bringen, selbst wenn sie in dieser Technik unerfahren sind. Mit Hilfe der laserbasierten Fluoreszenzdetektion kann jedes Zellereignis anhand von drei Zellparametern beurteilt werden.

Zellzyklusanalyse

Der Zellzyklus ist einer der bedeutendsten und fundamentalsten Prozesse in Eukaryonten, welcher die Basis von Zellwachstum und der Teilung in zwei Tochterzellen darstellt. Die Regulierung des Zellzyklus ist dabei essentiell für das Überleben der Zelle, da hierdurch die Reparatur genetischer Schäden gesteuert und eine unkontrollierte Zellteilung verhindert wird. Defekte in der Zellzyklusregulierung sind daher charakteristisch für Tumorzellen. Mutationen in Genen, die an der Kontrolle des Zellzyklus beteiligt sind, kommen bei Krebserkrankungen sehr häufig vor. Die Zellzyklusanalyse hat daher bei der Untersuchung der Wirkung von potenziellen Krebsmedikamenten oder der Erforschung der Zellteilungsmechanismen zunehmend an Bedeutung gewonnen.

Das Analysengerät ermöglicht eine schnelle und quantitative Bestimmung des prozentualen Anteils von Zellen in der G0/G1-, S- und G2/M-Phase des Zellzyklus. Der Assay vereinfacht dabei eine Analysenmethode, die traditionell komplexe Geräte und eine spezielle Unterweisung erfordert hat, und ermöglicht es dem Anwender, Informationen über die Zellzyklusverteilung direkt am Labortisch zu gewinnen.

Der nukleäre DNA-Farbstoff Propidiumiodid (PI) dient hier zur Unterscheidung von Zellen in den verschiedenen Stadien des Zellzyklus, da diese Zellen sich im DNA-Gehalt unterscheiden. Zellen in der Ruhephase (G0/G1) enthalten zwei Kopien jedes Chromosoms. Wenn die Zellen zur Vermehrung wieder in den Zyklus eintreten, synthetisieren sie neue chromosomale DNA (S-Phase). Die Fluoreszenz-intensität des DNA-Farbstoffs PI steigt daher an, bis die gesamte chromosomale DNA verdoppelt wurde (G2/M-Phase). In diesem Stadium fluoreszieren G2/M-Zellen mit der doppelten Intensität von G0/G1-Zellen. Die G2/M-Zellen teilen sich schließlich in zwei Zellen. Der Assay nutzt somit die unterschiedliche Anfärbung der Zellen auf Basis ihres DNA-Gehalts. Bild 2 zeigt die Auswirkungen verschiedener Einflüsse auf den Zellzyklus.

Apoptose-Nachweis

Die Apoptose, der programmierte Zelltod, ist ein wichtiger Regulator des Wachstums und der Proliferation von Zellen. Die Induktion der Apoptose ist durch eine Reihe biochemischer und morphologischer Zellveränderungen charakterisiert. Ein Merkmal der Apoptose ist die Translokation von Phosphatidylserin von der Innenseite der Plasmamembran auf die Außenseite. Dieses universelle Phänomen tritt dabei ungeachtet der Spezies, des Zelltyps und des Induktionssystems im Frühstadium der Apoptose auf. Bild 3 zeigt die Auswirkungen von Apoptose-induzierenden Substanzen auf zwei verschiedene Zelllinien (siehe Bildunterschrift).

Der Assay beruht auf dem Nachweis von Phosphatidylserin (PS) auf der Oberfläche apoptotischer Zellen mithilfe von fluoreszenzmarkiertem Annexin V in Kombination mit einem Marker für tote Zellen (7-AAD). Annexin V ist ein Ca2+-abhängiges Phospholipid-bindendes Protein mit einer hohen Affinität für PS, einer Membrankomponente, die normalerweise auf der Innenseite der Zellmembran lokalisiert ist. Im Frühstadium der Apoptose werden Phosphatidylserinmoleküle auf die nach außen gerichtete Oberfläche der Zellmembran verlagert, wo sie dann leicht vom Annexin V gebunden werden können. Im Spätstadium zeigen apoptotische Zellen dagegen einen Verlust der Membranintegrität. Der Membran-impermeable Farbstoff 7-AAD dient daher zur Unterscheidung toter Zellen von Zellen in einem frühen Apoptosestadium.
Der Assay kann vier Populationen unterscheiden:

  • Lebensfähige Zellen, die keine nachweisbare Apoptose durchlaufen: Annexin V (-) und Marker für tote Zellen (-).
  • Zellen in einem frühen Apoptosestadium: Annexin V (+) und Marker für tote Zellen (-).
  • Zellen in einem späten Apoptosestadium und tote Zellen: Annexin V (+) und Marker für tote Zellen (+).
  • Zelltod über einen nicht-apoptotischen Weg: Annexin V (-) und Marker für tote Zellen (+).

Integration von Durchflusszytometrie und Bildgebung

Viele Immunfunktionsassays erfordern eine Bildgebung zur genauen Analyse. Allerdings stellen Immunzellen aufgrund ihres geringen Vorkommens und der Notwendigkeit für eine simultane multispektrale Immunphänotypisierung eine signifikante Herausforderung für die bildbasierte Analyse dar und erschweren dadurch eine statistisch aussagekräftige Quantifizierung. Immunfunktionsassays werden deshalb am besten mit einer Technologieplattform durchgeführt, die Durchflusszytometrie und Bildgebung kombinieren kann (ImageStream®, Merck Millipore) und auch eine bildbasierte Quantifizierung großer Zellpopulationen ermöglicht.

Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems schützen den Wirt vor Pathogenen, während sie körpereigene Antigene tolerieren. Eine Funktionsstörung des Immunsystems kann zu Autoimmunerkrankungen oder Infektionen führen. Immunzellen analysieren ihre Umgebung durch Bindung und Verarbeitung löslicher Entzündungsmediatoren oder durch direkten Kontakt mit anderen Zellen, welcher zur Signaltransduktion und Aktivierung bzw. Unterdrückung einer Wirkung oder Funktion führt.

Nachstehend ist ein Beispiel eines Immunfunktionsassays angeführt, mit welchem die Aktivierung der NF-κB-Translokation gemessen wurde. Wie Bild 4 zeigt, exprimieren pDCs (plasmacytoid dendritic cells) Mustererkennungsrezeptoren, die nach Ligandenbindung aktivierende Signale aussenden. Die Translokation von NF-κB wurde dabei als Marker für die TLR7-induzierte Aktivierung von pDCs aus Vollblut eingesetzt. Die Analyse der NF-κB-Translokation in abgegrenzten pDCs, die verschiedenen R484-Dosen ausgesetzt wurden, erfolgte unter Verwendung des Similarity Score (J Immunol Methods 311:117). Es werden repräsentative Aufnahmen von Zellen der 1 ng/ml-Probe (links) und der 1000 ng/ml-Probe (rechts) gezeigt.

Mehr Informationen durch Multiplexing

Die Untersuchung individueller Biomarker, ob intrazellulär oder zirkulierend, ist oftmals nicht ausreichend, um Prozesse sowohl unter normalen Bedingungen als auch im Krankheitszustand vollständig zu charakterisieren. Die Multiplexanalyse von Analyten bietet hier erhebliche Vorteile bei der Untersuchung komplexer Reaktionswege und Biomarker-Interaktionen wie sie z.B. bei der Angiogenese auftreten.

Die Angiogenese, also die Bildung neuer Blutgefäße, ist ein streng kontrollierter Prozess, der eine wichtige Rolle bei normalem Wachstum, in der Entwicklung, Wundheilung und bei Transplantatabstoßung spielt. Wenn Signalwege der Angiogenese unterbrochen werden, kann eine unzureichende oder übermäßige Angiogenese Krankheiten wie Koronararterienerkrankungen, ischämische chronische Wundheilung, Autoimmunkrankheiten, Makuladegeneration und Krebs zur Folge haben. Die angiogene Signaltransduktion in Tumoren ist dabei ähnlich der normalen Angiogenese, die durch lösliche Wachstumsfaktoren, membrangebundene Rezeptoren und Zell-Zell- bzw. Zell-Matrix-Interaktionen vermittelt wird.

Traditionelle „Singleplex“-Proteindetektionsmethoden sind für eine effiziente Untersuchung von komplexen zellulären Signalwegen und Protein-Protein-Interaktionen, wie sie bei der Angiogenese vorkommen, nicht praktikabel. Die xMAP-Multiplex-Plattform (Luminex) ermöglicht Wissenschaftlern dagegen eine Differenzierung dutzender Analyten in einer Probe und reduziert damit erheblich den Zeit-, Arbeits- und Kostenaufwand, der ansonsten mit semi-quantitativen und durchsatzbegrenzten Methoden wie ELISA und Western Blots verbunden ist.

Die xMAP-Plattform verwendet eine Kombination aus fluoreszenzgefärbten magnetischen Mikrosphären (Beads), auf Durchflusszytometrie (LX200™ oder FLEXMAP 3D®) oder CCD-Kamera (MAGPIX®) basierten Geräten sowie Software für die Datenerfassung und -analyse. Mit der xMAP-Plattform werden im Prinzip Sandwich-Assays auf einem Bead ausgeführt. Jedes Bead wird mit zwei roten Farbstoffen eingefärbt. Jeweils zehn verschiedene Konzentrationen der beiden Farbstoffe ermöglichen dabei 100 verschiedene Kombinationen. Da die Beads in Lösung vorliegen und nicht auf einer Platte fixiert sind, können bis zu 50 verschiedene Beads mit unterschiedlichen Capture-Antikörpern in einer Probe eingesetzt und daher Ergebnisse für bis zu 50 verschiedene Proteine gleichzeitig gemessen werden. Wenn die Beads das Lesegerät passieren, oder im Falle der MAGPIX-Kamera in die Kammer strömen, wird die Bead-Nummer durch das Verhältnis der beiden Farbstoffe festgelegt.

Grün fluoreszierendes Streptavidin-Phycoerythrin wird als gemeinsames Detektionsreagenz für alle Analyten eingesetzt. Streptavidin-PE bindet dabei an die biotinylierten Detektions-Antikörper. Das Detektionssystem im Gerät misst rote und grüne Fluoreszenz und kann anhand dessen sowohl den Analyten identifizieren als auch die an das Bead gebundene Analyten-Menge quantifizieren.

Das MILLIPEX® MAP Angiogenesepanel (Merck Millipore) dient der Untersuchung von siebzehn Analyten, die an der Angiogenese beteiligt sind, und wird unter Verwendung des Luminex-Systems gemessen. Das konfigurierbare Panel enthält Komponenten zum Nachweis sowohl pro-angiogener als auch anti-angiogener Faktoren. Dies ermöglicht Wissenschaftlern die Untersuchung des Angiogeneseprozesses sowohl unter normalen Bedingungen als auch im Krankheitszustand, z.B. bei Krebs- und kardiovaskulären Erkrankungen.

Eine Reihe kommerziell erworbener Serumproben (Bioreclamation) wurde mit Hilfe des Angiogenese-Panels analysiert (Bild 5). Der Mittelwert für gesunde Kontrollpersonen (n = 8), Schwangere (n = 5) und verschiedene Tumortypen (n = 35) wird durch blaue Säulen für Kontrollproben, rote Säulen für Schwangere und grüne Säulen für verschiedene Tumortypen repräsentiert. Der Bildeinsatz zeigt zwei Analyten (Leptin und Angiopoietin-2), die höhere Serumwerte aufweisen als die anderen 15 Analyten in diesem Panel.

Multiplex-Analysen ermöglichen Wissenschaftlern die Untersuchung einer Vielzahl von Analyten in einer einzigen Probe und liefern damit mehr Informationen über komplexe Proteinwechselwirkungen und Signalwege als traditionelle Methoden.

Die vielleicht größte Herausforderung, der Wissenschaftler heute gegen-überstehen, ist die Erforschung der extremen Komplexität der Biologie und die Anwendung dieser Erkenntnisse auf die klinische Medizin. Sowohl die Grundlagenforschung als auch die Arzneimittelforschung werden durch den Einsatz leistungsstarker neuer Werkzeuge und Technologien vorangetrieben. Diese Ansätze ermöglichen die Untersuchung sowohl großer Zellpopulationen als auch einzelner Zellen und helfen bei der Aufklärung der wechselnden Dynamik in komplexen biologischen Netzwerken, die Gesundheits- und Krankheitszustände definieren.

Jason Whalley*)

  1. Senior Product Manager, Merck Millipore, E-Mail: jason.whalley@merckgroup.com.
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