MALDI-TOF-Massenspektrometrie zur Mikrobiom-Analyse

Was bakterielle Gemeinschaften über die Gesundheit von Salat verraten

Das pflanzliche Mikrobiom ist komplex und erst in Ansätzen untersucht. Forschende des Leibniz-Instituts für Gemüse- und Zierpflanzenbau (IGZ) haben nun eine Methode der Proteinmusteranalyse optimiert, um neue Fragen zu beantworten: Welche Bakterien leben auf einem Salatblatt? Und: Welche Rollen spielen sie da eigentlich?

Pflanzen beherbergen eine vielfältige mikrobielle Gemeinschaft, wie in dieser Platte aus Agar zu sehen ist, auf die ein Petersilienblatt gelegt wurde. Nach mehrtägiger Inkubation wuchsen die Mikroorganismen aus dem Blatt zu sichtbaren Kolonien. © IGZ

Pflanzen beherbergen eine enorme Anzahl an Mikroorganismen, die auf und in allen Pflanzenteilen siedeln. Dieses sogenannte Mikrobiom kann Pflanzen die Nährstoffaufnahme erleichtern, sie resistenter gegen Krankheitskeime machen oder helfen, stressige Situation wie Dürre und versalzene Böden zu überstehen. Bisher ist wenig über die genaue Funktion einzelner Bakterien und Pilze in diesen komplexen Gesellschaften bekannt. Das liegt vor allen Dingen daran, dass es eine große technische Herausforderung ist, das pflanzliche Mikrobiom in seine Einzelteile zu zerlegen und zu beschreiben. Katja Witzel und Silke Ruppel, Wissenschaftlerinnen am IGZ, haben eine Methode zur Massenspektrometrie-basierten Charakterisierung von Bakterien benutzt, um das pflanzliche Mikrobiom besser zu verstehen. Die Wissenschaftlerinnen berichten darüber im Journal of Advanced Research und International Journal of Molecular Sciences.

Bekannte Methode neu gedacht

„Wir wollen dem Mikrobiom der Pflanze Funktionen zuordnen“, erklärt Katja Witzel. „Dazu haben wir die bestehende Methode des MALDI-TOF-MS auf unsere Fragestellung angewandt.“ Im Prinzip trennt MALDI-TOF-MS (Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisation mit Flugzeitmassenspektrometer-Detektion) die Proteine von Bakterien anhand ihrer unterschiedlichen Molekülmassen auf und generiert für jede Probe ein spezifisches Proteinprofil, vergleichbar mit einem einzigartigen Fingerabdruck. Seit mehr als 20 Jahren wird die Methode in der klinischen Diagnostik zur Identifizierung von menschlichen Krankheitserregern genutzt, seit einigen Jahren auch zur Beschreibung der Funktionalität der menschlichen Darmflora.

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Die Forschenden am IGZ haben die Methode nun für pflanzliche Proben optimiert. Man nehme: ein Stück Pflanze – Endivienblatt, Thymianstrunk oder Kressepflänzchen – isoliere Mikroorganismen aus dieser Probe, kultiviere möglichst viele davon auf Nährmedium und bereite sie anschließend für die Analyse im MALDI-TOF-MS-Gerät auf. Jeder Bakterienstamm mit spezifischer Proteinzusammensetzung ergibt dabei ein einzigartiges Proteinprofil. In einem Gramm Pflanzenmaterial können sich Hunderte von kultivierbaren Bakterienstämmen finden. Die Proteinprofile werden anschließend mit bekannten Profilen in Datenbanken verglichen und so identifiziert. Um die Diversität der kultivierten Mikroorganismen so weit wie möglich abzudecken, werden alle Bakterienstämme mittels MALDI-TOF-MS analysiert (Beispiel s. Bild 1).

Bild 1: Mit den Augen des MALDI-TOF-MS gesehen, haben die drei Bakterienarten Rhizobium radiobacter, Bacillus licheniformis und Microbacterium phyllosphaerae völlig verschiedene Proteinprofile. Die Sequenz und Intensität der Massenpeaks, welche ionisierte, intakte Proteine repräsentieren und ein charakteristisches Profil der Mikroorganismen bilden, wird als Protein-Fingerprint bezeichnet und für die Ähnlichkeitssuche von Referenzspektren verwendet. Verschiedene Proteinprofile wiederum deuten auf verschiedene Funktionen und Aktivitäten der Bakterien hin. © IGZ

Alle Schritte – von der Bakterienkultivierung über die Proteinextraktion bis hin zur Probenpräparation – werden im Mikrotiterplattenmaßstab durchgeführt. Auf diese Weise wird ein hoher Probendurchsatz gewährleistet und ca. 300 Isolate können so innerhalb eines Tages analysiert werden.

Bild 2: MALDI-TOF MS erlaubt die schnelle und zuverlässige Differenzierung verschiedener Pseudomonas Arten. ©  IGZ

Um bei der Vielzahl von Bakterienisolaten von den Petersilienblättchen nicht den Überblick zu verlieren, wenden die Wissenschaftlerinnen den Trick der Dereplizierung an: „Mit ‚Dereplizierung‘ bezeichnen wir die Erkennung von Isolaten mit identischen Proteinprofilen, diese grenzen wir dann auf ein nicht-redundantes Isolat ein“, erklärt Katja Witzel. „Jeder Bakterienstamm mit einzigartigem Fingerabdruck wird dann weiter charakterisiert.“ (Beispiel s. Bild 2).

Viele Wege führen zum Mikrobiom

Im Gegensatz zu molekularbiologischen Untersuchungen, wie zum Beispiel der Metagenomanalyse, ist die Kultivierbarkeit der Mikroorganismen die Voraussetzung für die MALDI-TOF-MS. Viele Mikroorganismen wachsen auf und in einer Pflanze unter ganz besonderen Bedingungen – mit wenig Luft oder ganz bestimmten Nährstoffen. Diese Kleinstklimata sind im Labor nur unter sehr hohem technischem Aufwand herzustellen. Viele Mikroorganismen können deshalb bisher nicht kultiviert werden.

„Auf den ersten Blick gehen wir also einen Umweg – und kultivieren die Organismen zuerst“, erläutert Katja Witzel. „Allerdings ist das wichtig, wenn wir die Mikroorganismen danach auch zum Einsatz bringen möchten. Mikroorganismen, die per Sequenzierung auf der Pflanze nachgewiesen wurden, aber im Labor nicht wachsen, können wir nicht weiter auf ihre Funktion untersuchen.“

Gute Bakterien auf der Petersilie

Die Arbeitsgruppe “Nützliche Pflanzen-Mikroorganismen-Interaktionen” am IGZ wendet die optimierte Methode bereits erfolgreich an. „MALDI-TOF-MS erlaubt uns, die große Anzahl der Mikroorganismen im Mikrobiom einer Pflanze einzuschränken – also zu dereplizieren – auf einige, deren Funktion wir genauer studieren können“, erklärt Gruppenleiterin Silke Ruppel. Ihre Gruppe arbeitet daran, Bakterien auf und in Gemüse zu identifizieren, die nicht nur für die Pflanze von Bedeutung sind, sondern auch für den Salatgenießer, der Gemüse, Kräuter und Salat roh verzehrt.

Ihre Gruppe hat zum Beispiel das Vorkommen von Milchsäurebakterien auf Endivie, Thymian und Petersilie untersucht und berichtet darüber im International Journal of Molecular Sciences. Dabei stellte sie fest, dass sich die Bakteriengesellschaften zwischen den verschiedenen Pflanzenarten unterscheiden. Dies belegt die Diversität des pflanzlichen Mikrobioms, aber auch, wie sensibel die MALDI-TOF-MS-Methode ist.

Fazit

MALDI-TOF-MS ermöglicht eine schnelle, preisgünstige und genaue Klassifizierung und Charakterisierung von kultivierbaren Mikroorganismen. Die Methode wurde von Forschenden am Leibniz-Institut für Gemüse- und Zierpflanzenbau (IGZ) erfolgreich dafür verwendet, potenziell nutzbringende Bakterien auf Gemüse und Kräutern zu untersuchen. Welche Vor- und Nachteile die Methode bei der Analyse von pflanzlichen Mikroorganismen hat, sowie praktische Aspekte der Dereplikation, beschreiben die Forscherinnen im Journal of Advanced Research.

Originalpublikationen:

Doreen Huschek, Katja Witzel. 2019. Rapid dereplication of microbial isolates using matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry: A mini-review. Journal of Advanced Research. doi: 10.1016/j.jare.2019.03.007.

Sascha Patz, Katja Witzel, Ann-Christin Scherwinski, Silke Ruppel. 2019. Culture dependent and independent analysis of potential probiotic bacterial genera and species present in the phyllosphere of raw eaten produce. International Journal of Molecular Sciences. doi:10.3390/ijms20153661.

Leibniz-Institut für Gemüse- und Zierpflanzenbau (IGZ), Großbeeren
www.igzev.de

Der Artikel ist auch zu lesen in der März-Ausgabe der LABO: Hier geht es zum LABO E-Paper.

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