Konzentrationen von Mikroorganismen in Wässern schnell bestimmen

Durchflusszytometrie in der Wasseranalytik

Die Analyse von mikrobiologischen Kontaminationen in Wässern basiert bis heute im Wesentlichen auf der Kultivierung der Mikroorganismen auf entsprechenden Nährstoffplatten. Dieses Verfahren ist zeitaufwändig und bildet nur einen geringen Teil der im Medium vorhandenen Mikroorganismen ab, da nur ein geringer Prozentsatz der Organismen auf Platten mit Standardmedien kultivierbar ist. Die Methode führt daher in akuten Fällen der Verkeimung mit einem gesundheitsgefährdendem Potenzial, wie beispielsweise bei einer Kontamination mit Legionellen, zu unnötigen Zeitverzögerungen bei der Ergreifung von Gegenmaßnahmen.

© Alex Stemmers/stock.adobe.com

Einen deutlichen Vorteil im Hinblick auf eine schnelle Verfügbarkeit der Ergebnisse ist die Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren wird inzwischen erfolgreich für die mikrobielle Untersuchung von Trinkwässern und Prozesswässern eingesetzt. Dies liegt sowohl an der einfachen und verbesserten Benutzerfreundlichkeit der Systeme als auch an den in den letzten Jahren geringer gewordenen Investitionskosten für die Beschaffung eines leistungsfähigen Durchflusszytometers. Systematische Untersuchungen an Trinkwässern durch die EAWAG [1] und spätere Validierungen der Ergebnisse in Ringversuchen haben final dazu geführt, dass die Durchflusszytometrie mittlerweile in weiten Bereichen der mikrobiologischen Analytik verbreitet ist und unter anderem als reguläre Untersuchungsmethode Einzug in die Schweizer Gesetzgebung gehalten hat [2].

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Das Verfahren

Das grundlegende Prinzip eines Durchflusszytometers beruht auf der Erzeugung von Streulicht- und Fluoreszenzsignalen, die einzelnen Zellen zugeordnet werden können, nachdem sie perlschnurartig einen Laser passiert haben. Die Zellen werden dazu zunächst hydrodynamisch in einer Mantelflüssigkeit fokussiert, präzise vor dem Laser ausgerichtet und quantitativ analysiert. Durch Verwendung und Kombination verschiedener Fluorophore, Antikörper und physiologischen Markern können zudem phänotypische Merkmale und Aussagen zum physiologischen Zustand der einzelnen Zelle getroffen werden.

Die Anwendungsmöglichkeiten der Durchflusszytometrie umfasst einen sehr breiten Bereich von der mikrobiologischen Charakterisierung des Rohwassers bis zur Identifizierung von hygienischen Problemstellen innerhalb eines Leitungssystems. Durch die Verwendung der Durchflusszytometrie bei der Untersuchung der Veränderung der mikrobiologischen Wasserqualität innerhalb verschiedener Leitungspunkte von Gebäuden können so potenziellen Verkeimungsherde identifiziert und einer Reinigung zugeführt werden. In kommunalen Verteilungsnetzen können zudem Problembereiche mit höheren Bakterienkonzentrationen durch eine Kartierung der mikrobiellen Zellzahlen schnell und effektiv durchgeführt werden. Weiterhin kann der Erfolg von Desinfek-tionsmaßnahmen einfach und schnell überprüft werden, da die Abnahme intakter Zellen infolge chemischer Desinfektion mittels Durchflusszytometrie quantitativ gut abgebildet werden kann. Auch in der Wasseraufbereitung gibt die Änderung der Bakterienkonzentration über die einzelnen Stufen eines Aufbereitungsprozesses Aufschluss über die Behandlungseffizienz und ermöglicht prozesstechnische Optimierung [3].

Keimbelastung schnell erkennen

Density Plot der 675-nm-Fluoreszenz über der 530-nm-Fluoreszenz einer Bakterienpopulation in Wasser. Zu unterscheiden sind Populationen mit hohen DNA-Gehalten (HNA), geringen DNA-Gehalten (LNA) sowie der Anteil der Zellen mit defekten Membranen. © OMNI Life Science

Die Vorteile der Durchflusszytometrie sind dabei offensichtlich: Mit einer vorherigen fluoreszenzbasierten DNA-Färbung lassen sich die Wasserproben innerhalb weniger Sekunden hinsichtlich ihrer Keimbelastung analysieren. So können im Fall einer mikrobiologischen Kontamination schnell entsprechende Gegenmaßnahmen eingeleitet werden. Im Gegensatz dazu basiert die heutige, mikrobiologische Trinkwasseranalyse entsprechend den Richtlinien der Trinkwasserverordnung auf der traditionellen Ermittlung der koloniebildenden Einheiten (KBE) auf definierten Nährstoffplatten. Diese Verfahren sind zwar etabliert und in den Richtlinien der entsprechenden Verordnungen festgelegt, sie benötigen jedoch kostbare Zeit, die bei einem dringenden Verdacht auf eine Kontaminierung eines wasserführenden Systems nur begrenzt zur Verfügung steht. Wenn das Wasser zusätzlich auf die Abwesenheit spezifischer Keime (z. B. Legionellen oder coliforme Keime) untersucht werden muss, kann die Nachweiszeit mehrere Tage und Wochen in Anspruch nehmen. Ein weiterer Nachteil der Plattenmethode liegt zudem in der Tatsache, dass nur ein geringer Anteil der Organismen (0,1 – 1 %) auf Platten überhaupt kultivierbar ist. Die tatsächliche Anzahl der Mikroorganismen in einer Wasserprobe wird somit deutlich unterschätzt. Dieses Phänomen ist in der mikrobiellen Ökologie sehr gut bekannt und wird als „the great plate count anomaly“ [4] bezeichnet.

Doppelte Färbung

Die Markierung der Zellen vor der Analyse im Durchflusszytometer erfolgt durch eine doppelte Färbung mit einem Lebend- und Totfarbstoff. Der Totfarbstoff (Propidumiodide) wird von lebenden Mikroorganismen mit intakten Membranen exkludiert und markiert somit die Population der toten Zellen bzw. die Population der Zellen mit einer kompromittierten Zellmembran. Eine weitere Färbung mit einem membrangängigen Farbstoff färbt dagegen die gesamte Anzahl an Mikroorganismen in der Wasserprobe (TCC, total cell count). Grundsätzlich lässt sich also neben der Bestimmung der Gesamtbakterienzahl zudem der Anteil der toten oder inaktiven Bakterien im Wasser bestimmen.

Wie in Bild 1 zu sehen ist, lassen sich nach der Färbung und der erfolgten Analyse im Novocyte-Durchflusszytomer weitere verschiedene Populationen gut unterscheiden. Im unteren Bereich zeigt sich eine Bakterienpopulation mit einer geringen Fluoreszenz in den Kanal 530/30 nm (LNA, high nucleic acid content), die den geringen DNA-Gehalt dieser speziellen Population widerspiegelt. Daneben befindet sich eine weitere Population mit einer deutlich höheren DNA-Fluoreszenz (HNA, high nucleic acid content). Die beiden Populationen mit unterschiedlichen DNA-Gehalten finden sich bei durchflusszytometrischen Analysen von Wasser fast immer. Die Gründe für die unterschiedliche Färbecharakteristik sind dabei noch nicht vollständig verstanden. Unterschiedliche Wässer zeigen jedoch einen typischen „Fingerabdruck“ des HNA/LNA-Verhältnisses, der sich in Abhängigkeit der vorhandenen Nährstoffsituation ändern kann. So zeigen beispielsweise Wässer in einer Stagnationsphase höhere Anteile an HNA-Mikroorganismen als Wässer kurz nach einer erfolgten Spülung.

Demzufolge scheinen die unterschiedlichen Häufigkeiten der beiden Populationen den physiologischen Zustand der Mikroorganismen in Abhängigkeit der Nährstoffverfügbarkeit widerzuspiegeln. Die Durchflusszytometrie erlaubt es also, wichtige mikrobielle Parameter schnell und einfach zu erfassen und zudem Aussagen zum Nährstoffverfügbarkeit im Wasser abzuleiten. Die Empfindlichkeit der Methode liegt bei ca. 200 Zellen/ml – damit kann die Messung direkt an unverdünnten Wasserproben durchgeführt werden.

Volumetrisches Durchflusszytometer „NovoCyte“ zur Bestimmung der Gesamtzellzahl (TCC = total cell count) und des Anteils von Mikroorganismen mit zerstörten Zellmembranen. © Agilent

Ein System, das zur Wasseruntersuchung eingesetzt werden soll, sollte in der Lage sein, das Volumen der zu untersuchenden Wasserprobe exakt in die Flowzelle zu dosieren. Nur so kann ein eindeutiger Bezug der gemessenen Zellzahl zum Volumen erfolgen, um die notwendige Konzentrationsbestimmung der Zellen zu ermöglichen (volumetrische Analyse). Ein Spritzensystem macht die Probenzufuhr mit sehr hoher Genauigkeit mit geringen Abweichungen (< 5 %) möglich.

Auch das Probenaufkommen des Labors muss in die Planungen für die Anschaffung eines Systems mit einfließen. Ein Durchflusszytometer kann mit den klassischen Tubes betrieben werden. Es gibt aber auch viele Systeme mit einem Plattenloader, so dass die Proben automatisiert verarbeitet werden können. Auch die Standardisierbarkeit der Daten ist von Bedeutung: Systeme, die bei der Verwendung von 24 bit ADC (analog digital converter) einen großen dynamischen Bereich der Probe abbilden, können auf das Einstellen der Detektoren (voltage setting) und das damit verbundenen Fehlerrisiko verzichten.

Zukünftige Innovationen in der Durchflusszytometrie sind in der Automatisierung der Beprobung und einer semikontinuierlichen Überwachung von Systemen zu erwarten. In Verbindung mit neuen Verfahren zur Detektion von spezifischen Keimen, z. B. durch fluoreszenzmarkierte Nukleinsäure-Sonden oder Antikörper-basierte Anreicherungs- und Detektionsverfahren könnten wasserführende Systeme dann kontinuierlich hygienisch überwacht werden.

Anwendung in der Umweltanalytik

Neben der Durchflusszytometrie können auch weitere automatische Zellzählsysteme zur Gewässerüberwachung oder für die Einschätzung umwelttoxischer Potenziale eingesetzt werden. Ein gutes Beispiel hierfür ist der Einsatz eines Impedanz-basierten Casy Cell Counters. Phytotoxische Effekte von Wirkstoffen werden hierbei über die Zählung von einzelligen Grünalgen und deren Wachstumsrate quantifiziert. In einer Studie konnte dieses Verfahren z. B. anhand der toxischen Wirkung des Antibiotikums Ciprofloaxin gegenüber Raphidocelis supcapitata aufgezeigt werden. Das Casy-System erwies sich bei der Bestimmung der EC50 hierbei als sehr effektiv und schnell, da es simultan Aussagen zur Zellzahl, Zellgröße und zum Aggregationsverhalten von Zellen liefert [5].

Literatur

[1] Hammes F, Berney M, Vital M, Egli T. (2007): A protocol for the determination of total cell concentration of natural microbial communities in drinking water with FCM. Techneau report, Deliverable 3.3.7. Techneau, Niederlanden.

[2] Schweizer Lebensmittelhandbuch (2012): Methode 333.1; Schweizer Bundesamt für Gesundheit zur Bestimmung der „Totalzellzahl und des quantitativen Verhältnisses der Zellen niedrigen bzw. hohen Nukleinsäuregehaltes in Süßwasser“.

[3] Hammes F, Berney M, Wang Y, Vital M, Köster O, Egli T. ( 2008): Flow-cytometric total bacterial cell counts as a descriptive microbiological parameter for drinking water treatment processes. Water Research 42:269–277

[4] Staley J & Konopka A (1985): Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu Rev Microbiol 39: 321–346.

[5] Faetsch S, Matzke M, Stolte S (2017); https://cellcounting.de/wp-content/uploads/2014/06/Algae-Ciprofloxacin_CASY-AppNote_OLS.pdf

AUTOR
Dr. Thorsten Rieling
OMNI Life Science GmbH & Co. KG, Bremen
Tel. 0421/276169-0
info@ols-bio.de
www.ols-bio.de

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