Quantifizierung der lebenden Bakterien im Abwasser

Mikrobiologische Wasseranalytik mit qPCR

Der Autor dieses Artikels stellt ein beim Unternehmen DyeNA Genetics entwickeltes Verfahren vor, das qPCR so steuern kann, dass ausschließlich Genfragmente in einer Wasserprobe erkannt werden, die von lebenden Bakterien stammen.

© M-Production/stock.adobe.com

In der biologischen Abwasserreinigung erfolgt der Abbau der im Wasser enthaltenen anorganischen und organischen Stoffe durch Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze und Protozoen. Die Effizienz dieser mikrobiellen Reinigungsprozesse hängt maßgeblich von der Menge der lebenden Mikroorganismen ab. Über verschiedene Stoffwechselmechanismen der Mikroorganismen werden die Inhaltsstoffe des Abwassers in unterschiedliche Verbindungen umgewandelt bzw. abgebaut.

Veränderungen in der Zusammensetzung und Menge der mikrobiellen Gemeinschaften können zu Störungen führen und die Abwasserreinigung ineffizient machen. Unzureichend gereinigtes Abwasser stellt nicht nur eine Gesundheitsgefahr für den Menschen dar, sondern kann auch erhebliche Schäden in der Umwelt verursachen. Daher ist die Überwachung der mikrobiologischen Prozesse in Kläranlagen von entscheidender Bedeutung.

Mikroskopische Methode

Derzeit ist die Mikroskopie die vorherrschende Methode, um Indikatormikroorganismen im Abwasser zu bestimmen. Durch den zusätzlichen Einsatz von differenzierenden Färbungen oder der FISH-Technik (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) konnte die mikroskopische Identifizierung von Bakterienarten weiter verfeinert werden. Ein weiterer Grund für die weit verbreitete Nutzung des Mikroskops ist, dass hiermit eine klare Unterscheidung zwischen lebenden und abgestorbenen Zellen möglich ist. Da für Kläranlagenbetreiber nur die lebenden und aktiven Bakterien für die Reinigungsleistung relevant sind, war die Mikroskopie bisher hierfür besonders geeignet.

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Methode mit qPCR

Eine alternative Methode zur Quantifizierung von Bakterienarten ist die Real-Time-PCR (qPCR)-Technologie (qPCR = quantitative polymerase chain reaction). Diese Technologie wird heutzutage in Bereichen eingesetzt, in denen schnelle, hochspezifische, aussagekräftige und zuverlässige Ergebnisse von Bedeutung sind. Aufgrund ihrer Vorteile hat sich die qPCR-Technologie erfolgreich als grundlegende Methode in der Lebensmittelanalytik sowie in der veterinär- und humanmedizinischen Diagnostik etabliert. Bei der qPCR-Methode werden spezifische Gensequenzen von Bakterien verwendet, die es ermöglichen, ein bestimmtes Bakterium eindeutig zu identifizieren. Diese Sequenzen werden mit Gensonden erkannt, vervielfältigt (amplifiziert) und die Menge durch das dabei entstehende Fluoreszenzsignal quantifiziert (s. auch Schema). Die qPCR-Technologie kann normalerweise jedoch nicht unterscheiden, ob Genfragmente von lebenden oder bereits abgestorbenen Bakterien stammen. Dies war ein bedeutender Nachteil der qPCR-Methode und der Hauptgrund, warum sie in der mikrobiologischen Abwasseranalytik bisher nur begrenzte Anwendung gefunden hat.

Beim Unternehmen DyeNA Genetics wurde ein innovatives Verfahren entwickelt, das die qPCR so steuern kann, dass ausschließlich Genfragmente in einer Abwasserprobe erkannt werden, die von lebendigen und somit aktiven Bakterien stammen. Dies ermöglicht es, tote oder geschädigte Bakterienzellen aus der Quantifizierung auszuschließen. Hierdurch wird es Kläranlagenbetreiber möglich, aus der qPCR die für sie wichtige Information über die bakterielle Lebendzellzahl im Abwasser zu erhalten und das mit einer höheren Aussagekraft als mit Hilfe der Mikroskopie.

Die qPCR-Methode bietet Kläranlagenbetreibern eine Reihe weiterer Vorteile: beispielsweise eine erheblich verkürzte Analysezeit, da sie nicht die zeitaufwändige manuelle Zählung von Zellen erfordert, und durch die Spezifität verbesserte Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Bakterienbestimmung im Vergleich zur FISH-Mikroskopie. Darüber hinaus wird durch die Automatisierung der Analyseprozesse hohe Präzision und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erzielt, da die subjektive Interpretation eines menschlichen Beobachters hier keinen Einfluss nimmt.

Oben: Probenvorbereitung. Zunächst werden die Zellwände der Mikroorganismen in der Probe aufgebrochen, um die DNA-Moleküle freizusetzen. Dies wird mittels DNA-Extraktion erreicht. Die resultierende Lösung, die sowohl freie DNA als auch aufgebrochene Zellfragmente enthält, wird auf Extraktionssäulen aufgetragen. Diese Säulen ermöglichen es, die Zellfragmente von der freien DNA zu trennen. Die DNA heftet sich an die Säulenmatrix und wird zurückgehalten, während die Zellfragmente die Säule passieren. Zum Schluss wird die DNA mithilfe eines speziellen Puffers von der Säule gelöst. Die extrahierte DNA ist von hoher Reinheit und spiegelt die ursprüngliche mikrobiologische Situation in der Probe genau wider. Unten: Vorgehensweise bei der qPCR-Analyse. Die zuvor extrahierte DNA-Probe wird mit einem bakterienspezifischen qPCR-Test gemischt,in ein Reaktionsgefäß pipettiert und in den Thermocycler verbracht. Durch zyklisches Erhöhen bzw. Absenken der Temperatur im Reaktionsgefäß werden die DNA-Moleküle enzymatisch vervielfältigt. Dabei entsteht das Fluoreszenzsignal. Zum Schluss berechnet eine Software anhand der Fluoreszenzintensität im Reaktionsgefäß die Menge der DNA in der ursprünglichen Probe. © DyeNA Genetics

Mit der FISH-Mikroskopie kann man auch erkennen, wie verschiedene Bakterien miteinander vergesellschaftet sind, beispielsweise ob Bakterien mit komplementärem Stoffwechsel wie Ammonium-Oxidierer und Nitrit-Oxidierer räumlich nahe beieinander sind. Diese räumliche Anordnung kann mit der qPCR nicht direkt ermittelt werden. Allerdings kann durch die Berechnung der Verhältnisse der Bakterien, die sich ergänzen, eine mögliche Vergesellschaftung in der untersuchten Probe eingeschätzt werden.

Eine qPCR-Platte wird in den Thermocycler eingesetzt. © DyeNA Genetics

Analog zu ihrem Einsatz in der Lebensmittelanalytik sowie in der veterinär- und humanmedizinischen Diagnostik eröffnen sich auch im Bereich der mikrobiologischen Abwasseranalytik mittels qPCR zahlreiche zusätzliche Anwendungsmöglichkeiten zur Überwachung biologischer Betriebsprozesse. Über die laufende Beobachtung der Aktivität von Mikroorganismen, die an den Abbauprozessen beteiligt sind, kann beispielsweise der biologische Stickstoffabbau im Belebungsbecken bewertet werden. So lassen sich mit Hilfe der Ergebnisse aus den qPCR-Analysen Betriebsprozesse optimieren, Störungen rechtzeitig erkennen und angemessene Gegenmaßnahmen zügig einleiten. Ein anschauliches Beispiel hierfür ist die Bekämpfung von Bläh- und Schwimmschlamm, der durch Microthrix parvicella verursacht wird. Mithilfe der qPCR-Methode kann ein einsetzendes Massenwachstum, insbesondere in den kälteren Jahreszeiten, rechtzeitig erkannt werden, und so können unverzüglich gezielte Bekämpfungsmaßnahmen ergriffen werden. Mit Hilfe der Ergebnisse aus den qPCR-Analysen lassen sich gezielte Optimierungsmaßnahmen treffen und effizient steuern, was auch zur Störungsprävention beiträgt.

Weiterhin ermöglicht die qPCR den Nachweis von pathogenen oder multiresistenten Mikroorganismen im Abwasser, wodurch eine Überwachung und potenzieller Gesundheitsrisiken und von Infektionsgeschehen möglich wird. Ein aktuelles Beispiel ist das kommunale Coronavirus-Abwassermonitoring.

Fazit

Über die genaue Quantifizierung der lebenden Bakterien in einer Probe kann die mikrobiologische Abbaufähigkeit sehr gut beurteilt werden. Die qPCR- Methode stellt hier eine leistungsstarke und fortschrittliche Technik dar, um die Prozesse in Kläranlagen präziser zu überwachen und zu optimieren. Die vielfältigen Anwendungsbereiche zeigen den Nutzen der qPCR in der mikrobiologischen Abwasseranalytik für eine effiziente und sichere Abwasserbehandlung.

AUTOR
Dr. Thomas Benkert
DyeNA Genetics GmbH, Schweinfurt
Tel.: 09721/9486610
[email protected]
www.dyena-genetics.de

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