Unbekannte Stoffe identifizieren

Mit modernsten Analysenmethoden auf Spurensuche

Abwässer aus industriellen Prozessen müssen vor der Entsorgung aufgearbeitet werden. Dabei gilt es auch unbekannte Stoffe zu identifizieren. Bei dieser Analytik können Offline-2D-Chromatographie und Non-Target Screening eingesetzt werden.

© Kvadrat/Shutterstock.com

Industrielle Abwässer sind ein Nebenprodukt industrieller Prozesse. Ob für Lebensmittel, Kleidung, Papier oder chemische Produkte, für nahezu jeden Produktionsschritt wird Wasser benötigt. Das dabei entstandene Abwasser muss unter Beachtung der Umweltschutzgesetze vor der Entsorgung unter behördlichen Vorgaben aufgearbeitet werden. Solche Abwässer sind in ihrer Zusammensetzung sehr unterschiedlich und können sowohl bekannte als auch unbekannte, organische und/oder anorganische Stoffe enthalten. Diese gilt es, durch eine umfangreiche Wasseranalytik zu überwachen und zu kontrollieren.

Der Chempark, mit seinen Standorten in Leverkusen, Dormagen und Krefeld Uerdingen, ist eines der größten Chemieareale in ganz Europa. Hier werden mehr als 5 000 Chemikalien hergestellt und in den entsprechenden Recycling-Zentren entsorgt. Currenta als Chempark-Manager und -Betreiber bietet an den drei Standorten für insgesamt ca. 70 Produktions- und Dienstleistungsunternehmen Dienstleistungen im chemisch-technischen Bereich an. Dazu zählen Energieversorgung, Entsorgung, Infrastruktur, Sicherheit, Analytik sowie Ausbildung. Damit ist Currenta auch für die Gewährleistung der Funktion der Kläranlage und für die Kontrolle der Betriebe verantwortlich. Daher wird im Bereich der Umweltüberwachung eine regelmäßige Kontrolle des Abwassers durchgeführt. Das Spektrum erstreckt sich dabei von chemisch-physikalischen Messverfahren, Abwasser- und Luftanalysen über biologisch-ökotoxikologische Prüfungen bis hin zur Erstellung von Stoffdossiers. So können alle erforderlichen Nachweise erbracht und Bewertungen organischer und anorganischer Stoffe in Luft, Boden, Wasser und Abfall bis in den Ultraspurenbereich durchgeführt werden.

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Wasseranalytik als wichtiger Teil der Umweltüberwachung

Die Analyse von Abwässern der chemischen Industrie stellt insbesondere bei Proben, die vor der Abwasserreinigung gezogen werden, aufgrund der hohen Belastung durch (an)organische Verbindungen in komplexer Matrix eine besondere Herausforderung dar. Zur Überwachung wird in einem Routinescreening das anfallende Abwasser, beispielsweise mittels Flüssigkeitschromatographie und UV-Detektion (LC-UV), auf bestimmte Stoffe analysiert. Es können aber auch Verbindungen in dem Kläranlagenzulauf detektiert werden, die zunächst nicht eindeutig identifizierbar sind. Tauchen diese wiederholt auf, werden sie einer Liste von sogenannten „bekannten unbekannten“ Stoffen (s. Infokasten) zur weiteren Identifizierung hinzugefügt. Ihre Aufklärung steht für die Betreiber der Kläranlagen im Vordergrund, denn es muss sichergestellt werden, dass von solchen Verbindungen keine Gefahr für die Mikroorganismen der Kläranlage ausgeht.

Durch Kopplungstechniken zur Strukturaufklärung

Die Flüssigkeitschromatographie gekoppelt an die hochauflösende Massenspektrometrie (LC-HRMS) in Verbindung mit dem Non-Target Screening Ansatz (NTS) wird heutzutage häufig zum Nachweis und zur Identifizierung unbekannter Verbindungen in Oberflächen- und Abwässern eingesetzt [1] – [6]. Die organischen Verunreinigungen, die nicht durch routinemäßige Analyse bekannter Verbindungen erfasst werden, können durch das NTS identifiziert werden. Angewandt wird das NTS, wenn keine vorherigen Informationen über die Probe verfügbar sind, nach zusätzlich vorhandenen Substanzen gesucht werden soll und wenn deren Charakterisierung erwünscht ist [2]. Beim NTS können sowohl bekannte Substanzen als auch bisher nicht erkannte und unbekannte Substanzen nachgewiesen werden [3], [7], [8].

Die Grundlage des Verfahrens liegt in der Datenauswertung. Die allgemeine Datenprozessierung mit unterschiedlicher Reihenfolge in jedem Arbeitsablauf umfasst das Auffinden chromatographischer Merkmale (Features*) mittels geeigneter Peakfinding-Software, eine Komponentisierung, welche alle Signale der ursprünglichen Komponenten (Isotopenpeaks, Addukt-Ionen und In-source-Fragmente aus der Ionenquelle) zusammenfasst sowie die Entfernung von falsch positiven Features durch Blindwertkorrekturen [9]. Industrieabwässer, als komplexe chemische Gemische mit Tausenden von Einzelsubstanzen, erzeugen in der LC-HRMS-Analyse eine hohe Anzahl an Signalen. Ihre vollständige Aufklärung unter Verwendung vom NTS ist aufgrund der hohen Variabilität technologisch anspruchsvoll und zeitaufwendig. Die vollständige Aufklärung stellt insofern kein Routineüberwachungsprogramm dar. Vielmehr soll die Aufklärung von umweltrelevanten, wiederholt detektierten Verbindungen im Vordergrund stehen. Daher wird bei der Datenauswertung eine Auswahl potentiell interessanter Signale (Peak-Priorisierung) empfohlen, welche zusätzliche Maßnahmen zur Vereinfachung der Identifizierung, wie zum Beispiel der Trennung von Störsignalen, ermöglichen.

*Anmerkung: Features sind datenreduzierte Signale mit einem definierten Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/z), das an einer entsprechenden Retentionszeit und Intensität ausgerichtet ist.

Verschiedene Detektionstechniken nutzen

Bild 1: Systematische Darstellung der vorgestellten offline 2D-HeartCut-LC-UV / LC-HRMS Priorisierungsmethode zur Identifizierung unbekannter Stoffe in Industrieabwässern [10]. © Currenta

Eine Möglichkeit für die Identifizierung unbekannter Verbindungen bietet die Priorisierungsstrategie der (offline) zweidimensionalen Flüssigkeitschromatographie gekoppelt an zwei unterschiedliche Detektionstechniken (UV und MS) . In der ersten Dimension können Abwasserproben durch eine etablierte Routinemultikomponentenmethode mittels LC-UV analysiert werden. Wiederholt auftretende unbekannte Verbindungen können manuell fraktioniert werden und in der zweiten Dimension weiter aufgereinigt und deren Strukturen mit Hilfe der hochauflösenden Massenspektrometrie und dem NTS aufgeklärt werden (Bild 1).

Anwendungstest an einer Beispielsubstanz

Für die Aufklärung einer Beispielsubstanz wurde eine der „bekannten Unbekannten“ ausgewählt. Die Verbindung weist eine Retentionszeit von 41,1 Minuten in der ersten Dimension auf und hat ihre maximale UV-Absorption bei 240 nm. Die aus der ersten Dimension gewonnene Elutionsmittelfraktion führt in der zweiten Dimension (LC-ESI-HRMS) zu 1 610 Features im negativen Elektrosprayionisationsmodus und 3 170 Features im positiven Ionisationsmodus. Nach der Datenprozessierung bleiben im negativen Modus fünf relevante Merkmale erhalten. Im positiven Modus bleibt nach Ausschluss falsch positiver Treffer und Adduktgruppierung nur ein Feature übrig, welches aufgrund der Retentionszeit, der genauen Masse und der signifikanten Fragmente zu einer Verbindung aus dem negativen Ionisationsmodus zugeordnet werden kann. Aufgrund der Isolierung der unbekannten Verbindung in der ersten Dimension sollte diese in der zweiten Dimension das höchste Signal darstellen. Der weitere Identifikationsschwerpunkt liegt daher auf dem Feature mit der höchsten Intensität des negativen Ionisationsmodus (m/z 250,9262; tR = 11,17 min und Intensität = 6,02 E+04 cps).

Bild 2: Vergleich des Referenzstandards (3,4-Dichlor-2,6-dinitrophenol) (obere Reihe, 50 μg/l) und der Elutionsmittelfraktion der Abwasserprobe (untere Reihe). Gezeigt werden die UV-Spektren von (a) dem Standard und (d) der Fraktion; jeweils ein Ausschnitt aus dem MS-Spektrum von (b) dem Mutterion m/z 250,9265 des Standards und (e) dem Mutterion m/z 250,9265 der Fraktion mit identischem Isotopenmuster; die MS/MS-Spektren vom (c) Standard und (f) der Elutionsmittelfraktion [10]. © Currenta

Im nächsten Schritt können anhand der exakten Masse Rückschlüsse auf eine mögliche Summenformel gezogen werden. In diesem Fall wird die empirische Formel C6H2Cl2N2O5, unter der Annahme, dass es sich um dichlordinitrosubstituierte Phenole handeln könnte, ausgewählt. Das Massenspektrum bestätigt die angenommenen Kandidaten mit dem typischen Isotopenmuster einer Dichlorierung (35Cl2: 100 %, 35Cl37Cl: 63,99 %, 37Cl2: 10,24 %). Das Isotopenmuster der Dichlorierung im MS-Spektrum, das MS/MS-Spektrum, das berechnete Doppelbindungsäquivalent von sechs (fünf Doppelbindungen und eine Ringstruktur) und die Ionisierung im negativen Modus stützen diese Annahme zusätzlich. Zur Überprüfung der Hypothese wurden die Retentionszeiten und die Spektren der Unbekannten (UV, MS, MS/MS) mit einer kommerziell verfügbaren Referenzsubstanz (3,4-Dichlor-2,6-dinitrophenol, s. Bild 2) verglichen. Zusammenfassend stimmten alle MS-, MS/MS- und UV-Spektren sowie die Retentionszeiten überein, was somit zu einer Level-1-Identifizierung nach Schymanski et al. [11] führt.

Nach erfolgreicher Aufklärung der vormals unbekannten Verbindung als Dichlordinitrophenol wird diese anschließend in realen Abwasserproben (ohne Fraktionierung) rückwirkend näherungsweise unter Verwendung des Referenzstandards quantifiziert. Die Analysen der Wasserproben der Industrieanlagen, Kläranlagen und Kläranlagenauslässe zeigt, dass das substituierte Phenol in der Kläranlage gut abgebaut wird und daher für die Umwelt keine Gefahr verursacht.

Fazit

Wie beispielhaft dargestellt können unbekannte Verbindungen aus Abwasserproben durch die Priorisierungsstrategie der (offline) zweidimensionalen LC-UV/LC-HRMS mit Non-Target Analyse aufgeklärt werden. Der vorgestellte Ansatz beschreibt damit einen einfachen, leistungsstarken Beitrag zur optimierten Aufreinigung von Industrieabwässern (durch die erste Dimension), was eine Datenreduzierung zur Folge hat und damit Identifizierungen mittels NTS realisierbar macht. Der Einsatz der NTS ermöglicht zudem einen retrospektiven Nachweis darüber, woher die detektierte Substanz stammt, in welcher Konzentration sie auftaucht und wie sie in der Kläranlage abgebaut wird.

AUTOREN

Kirsten Purschke
Markus Weber
Currenta GmbH & Co. OHG, Abt. Umweltanalytik, CHEMPARK Leverkusen

Juri Leonhardt
Currenta GmbH & Co. OHG, Abt. Produktionsanalytik, CHEMPARK Dormagen

Torsten C. Schmidt
Instrumentelle Analytische Chemie (IAC) und Zentrum für Wasser- und Umweltforschung Research (ZWU), Universität Duisburg-Essen, Essen

Literatur

[1] F. Freeling et al., “Occurrence and potential environmental risk of surfactants and their transformation products discharged by wastewater treatment plants,” Sci. Total Environ., vol. 681, no. September, pp. 475–487, 2019.

[2] C. Ruttkies, E. L. Schymanski, A. J. Williams, and M. Krauss, “Supporting non-target identification by adding hydrogen deuterium exchange MS / MS capabilities to MetFrag,” Anal. Bioanal. Chem., 2019.

[3] G. Nürenberg, M. Schulz, U. Kunkel, and T. A. Ternes, “Development and validation of a generic nontarget method based on liquid chromatography - high resolution mass spectrometry analysis for the evaluation of different wastewater treatment options,” J. Chromatogr. A, vol. 1426, pp. 77–90, 2015.

[4] K. T. Peter, C. Wu, Z. Tian, and E. P. Kolodziej, “Application of Non-Target High Resolution Mass Spectrometry Data to Quantitative Source Apportionment,” Environ. Sci. Technol., 2019.

[5] S. Samanipour, J. W. O’Brien, M. Reid, and K. V. Thomas, “A Self Adjusting Algorithm for the Non-targeted Feature Detection of High Resolution Mass Spectrometry Coupled with Liquid Chromatography Profile Data,” Anal. Chem., p. acs.analchem.9b02422, 2019.

[6] B. L. Milman and I. K. Zhurkovich, “The chemical space for non-target analysis,” Trends Anal. Chem., vol. 97, pp. 179–187, 2017.

[7] P. Gago-Ferrero, E. L. Schymanski, A. A. Bletsou, R. Aalizadeh, J. Hollender, and N. S. Thomaidis, “Extended Suspect and Non-Target Strategies to Characterize Emerging Polar Organic Contaminants in Raw Wastewater with LC-HRMS/MS,” Environ. Sci. Technol., vol. 49, no. 20, pp. 12333–12341, 2015.

[8] C. Hug, N. Ulrich, T. Schulze, W. Brack, and M. Krauss, “Identification of novel micropollutants in wastewater by a combination of suspect and nontarget screening,” Environ. Pollut., vol. 184, pp. 25–32, 2014.

[9] T. Bader, W. Schulz, K. Kümmerer, and R. Winzenbacher, “LC-HRMS Data Processing Strategy for Reliable Sample Comparison Exemplified by the Assessment of Water Treatment Processes,” Anal. Chem., vol. 89, no. 24, pp. 13219–13226, 2017.

1. Purschke, C. Zoell, J. Leonhardt, M. Weber, and T. C. Schmidt, “Identification of unknowns in industrial wastewater using offline 2D chromatography and non-target screening,” Sci. Total Environ., 2020.

2. L. Schymanski et al., “Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: Communicating confidence,” Environ. Sci. Technol., vol. 48, no. 4, pp. 2097–2098, 2014.

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