Umweltanalytik

Zwei Seiten einer Medaille

Was die Kopplung von Dünnschichtchromatographie (DC) und biologischen Wirktests für eine umfassende Bewertung von Umweltproben leisten kann, zeigen die Autoren von der Bundesanstalt für Gewässerkunde in Koblenz in diesem Fachbeitrag.

© shutterstock/kovop58

Stoffliche Belastungen in der Umwelt führen häufig zu unerwünschten Wirkungen auf Menschen, Tiere und Pflanzen. Für eine umfassende Bewertung von Umweltproben sind sowohl die Analyse der stofflichen Zusammensetzung als auch eine (öko-)toxikologische Charakterisierung notwendig. Wirkungsanalysen und chemische Analysen sind somit quasi die „zwei Seiten einer Medaille“.

Die Herausforderung

Durch den Menschen wird eine Vielzahl von Substanzen in die aquatische Umwelt eingetragen. Diese Substanzen können nachteilige Auswirkungen auf natürliche Lebewesen in der Umwelt haben – und falls sie in Lebensmittel oder das Grundwasser gelangen auch die menschliche Gesundheit beeinträchtigen. Eine umfassende Überwachung eingetragener Verbindungen, die ausschließlich auf einer gezielten chemischen Analyse basiert, ist nicht möglich – nicht zuletzt weil Stoffe in der Umwelt verschiedensten chemischen Umwandlungsprozessen unterliegen. Dabei können unbekannte Umwandlungsprodukte entstehen, die mit den gängigen chemisch-analytischen Messmethoden nicht erfasst werden, aber durchaus nachteilige Auswirkungen auf Mensch und Umwelt haben können. Auch aus diesem Grund sind wirkungsbasierte Methoden bei der Bewertung der Wasserqualität ein essenzielles komplementäres Element zur chemischen Analytik.

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Grundsätzlich lässt sich mit biologischen Verfahren die summarische Wirkung aller in einer Probe vorkommenden Substanzen erfassen. Vor diesem Hintergrund wird derzeit eine Nutzung biologischer Testverfahren im Rahmen der Wasserrahmenrichtlinie (WRRL) diskutiert. Eine nachgewiesene biologische Aktivität durch Wirktests allein kann aber aufgrund der oft komplexen Zusammensetzung von Umweltproben die Frage nach der stofflichen Ursache der Wirkung meist nicht direkt beantworten. So sind Stoffe in der Umwelt und die durch sie verursachten Wirkungen eng miteinander verknüpft; die gängigen Verfahren erlauben jedoch zunächst entweder nur die Sicht auf die stoffliche Seite der Medaille – oder aber auf die Seite der biologischen Wirkungen.

Der Lösungsansatz

Die wirkungsorientierte Analytik kombiniert die chromatographische Trennung von Umweltproben mit biologischen Testverfahren und chemischer Analytik und erfasst so beide Blickwinkel mit dem Ziel, Stoffe mit nachteiligen biologischen Wirkungen zu identifizieren. An diesem Punkt setzt das Vorhaben „TREES - TRacking Effects of Environmental organic micro-pollutants in the Subsurface“ an, das durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) im Rahmen der Deutsch-Israelischen Wassertechnologiekooperation gefördert wird. Die Grundidee des Vorhabens besteht in einer direkten Kopplung von DC (zur Trennung von Substanzgemischen) mit biologischen und chemischen Nachweismethoden. Durch die Nutzung spezifischer biologischer Verfahren, z. B. zur Erkennung hormonell aktiver Substanzen, werden alle Stoffe in einer Probe erkannt, die diese in der Umwelt unerwünschte Eigenschaft haben.

Beispiel: Östrogenähnliche Effekte

Bild 1: Östrogene Effekte in angereicherten (1000  x) Abwasserproben. Teststamm: S. cerevisiae Yeast Estrogen Screen [2], mobile Phase: Chloroform/Ethylacetat/Petrolether 55 : 20 : 25 (V/V/V) [3], Detektion: b-Galactosidase als Reporter mittels MUG. Ref1: Estron (E1, 10 pg/spot), Estradiol (E2, 1 pg/spot), Estriol (E3, 100 pg/spot); Ref2: Ethinylestradiol (EE2, 1 pg/spot). Das Balkendiagramm zeigt die quantifizierten Estradiol-Äquivalenzkonzentrationen für die Zielanalyten E1, EE2 und E2 (oberhalb der x-Achse) und weitere bislang nicht identifizierte östrogenähnlich wirkende Substanzen (X1 bis X4, unterhalb der x-Achse). © BfG

Die Östrogene 17b-Estradiol (E2), Estron (E1) und das als Kontrazeptivum eingesetzte 17a-Ethinylestradiol (EE2) wurden in das Monitoringprogramm der EU-Watch-List aufgenommen. Die sehr geringen Grenzwerte von 400 pg/l für E2 und sogar 35 pg/l für EE2 stellen eine analytische Herausforderung dar. Gleichzeitig ist bekannt, dass neben den genannten Verbindungen weitere Substanzen mit östrogenartiger Wirkung in Umweltproben vorkommen. 

Wie in Bild 1 dargestellt, kann die Kopplung von DC und Yeast Estrogen Screen (p-YES) dazu genutzt werden, um analog einer chemischen Analytik Zielverbindungen wie E2, E1 und EE2 mit einer ausreichenden Sensitivität zu quantifizieren und gleichzeitig weitere Verbindungen mit dem gleichen Wirkmechanismus zu detektieren [1]. Damit ist es möglich den Anteil der Zielverbindungen an dem gesamten östrogenen Potenzial der Probe zu bestimmen und so Hinweise auf die Gegenwart weiterer, möglicherweise problematischer Stoffe zu erhalten. So wird beispielsweise die östrogene Gesamtaktivität in der Abwasserprobe S20 durch die Watch-List-Substanzen E1, E2 und EE2 dominiert, wohingegen die Proben S19 und S16 zu einem hohen Anteil weitere östrogenartig wirkende Substanzen enthalten.

Weitere Wirktests

Bild 2: Charakterisierung angereicherter Zu- und Ablaufproben einer kommunalen Kläranlage. Oberhalb der Spuren sind der jeweilige Anreicherungs­faktor der Probe und das Auftragsvolumen angegeben. Die Position der eingesetzten Referenzsubstanzen nach der Chromatographie auf ­Silica-Platten (Silica Gel 60G F254, 20 × 10 cm, Merck) ist mit Buchstaben von A bis H gekennzeichnet. Androgenität (links) Teststamm: S. cerevisiae Yeast Androgen Screen [4], mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan 50 : 50 (V/V) [5], Detektion: b-Galactosidase als Reporter mittels MUG. Gentoxizität (Mitte) Teststamm: E. coli mit recA::luxCDABE [6], mobile Phase: nach Schulz et al. 2017 [7], Detektion: Luciferase als Reporter mittels Biolumineszenz. PSII-­Inhibition (rechts) Teststamm: Desmodesmus subspicatus, mobile Phase: Chloroform/Ethylacetat/Petrolether 55 : 20 : 25 (V/V/V) [11], Detektion: variable ­Fluoreszenz mittels Imaging Pulse Amplitude Modulator (IPAM) Fluorometer. © BfG

Im Rahmen des oben genannten Forschungsprojekts wurden eine Reihe weiterer spezifischer Testverfahren mit der DC gekoppelt. Bild 2 zeigt beispielhaft die Charakterisierung angereicherter Zu- und Ablaufproben einer kommunalen Kläranlage. Dazu wurden Aliquote der Proben hinsichtlich androgener und gentoxischer Effekte sowie auf die Gegenwart von Inhibitoren des Photosystems II (PSII) untersucht. Das letztgenannte Verfahren erlaubt die Detektion von Substanzen, die die Photosyntheseaktivität beeinträchtigen. Die Ergebnisse zeigen im 50-fach angereicherten Zulauf der Kläranlage die androgen wirksamen Substanzen Testosteron und Dihydrotestosteron. Diese Verbindungen konnten auch massenspektrometrisch nach Extraktion von der Dünnschichtplatte nachgewiesen werden. Darüber hinaus treten aber mindestens zwei weitere androgen wirksame Substanzen in der Probe auf.

© BfG

Durch die Abwasserbehandlung wurden androgen wirkende Substanzen effizient entfernt. Im Gegensatz dazu ist die Gentoxizität der Proben im Vergleich zwischen Zulauf und Ablauf erhöht. Die stoffliche Ursache für den beobachteten Effekt konnte bislang nicht identifiziert werden. Die Methode erlaubt jedoch eine schnelle Falsifizierung von Substanzen durch die parallele Untersuchung auf der Dünnschichtplatte. Im Vergleich zur Entfernung androgen wirksamer Verbindungen ist auch die Elimination von PSII-Inhibitoren weniger effizient. Die Ergebnisse lassen die Gegenwart von Atrazin und Diuron in der Ablaufprobe vermuten. Darüber hinaus lassen sich deutliche Hemmsignale detektieren, die durch Verbindungen mit einer höheren Polarität hervorgerufen werden, die durch eine geringe Migration auf der Dünnschichtplatte erkennbar sind.

Fazit

Der hier vorgestellte methodische Ansatz kann für eine Vielzahl von Fragestellungen und Aufgaben – so z. B. die Überwachung von Oberflächen-, Grund- und Trinkwasser, aber auch die Kontrolle von Kläranlagen oder Deponiesickerwässern – eingesetzt werden. Damit kann diese Technik entscheidend dazu beitragen, Mensch und Umwelt vor schadhaften Effekten von durch den Menschen freigesetzten Substanzen zu schützen. Neben der Kopplung weiterer Wirktests ist eine Herausforderung für die Weiterentwicklung dieser Technik die Verbesserung der chromatographischen Trennleistung, z. B. durch die Verwendung alternativer mobiler und stationärer Phasen oder eine zweidimensionale Trennung [8, 9, 10].

© BfG

Danksagung
Das Projekt TREES wird im Rahmen der Deutsch-Israelischen Wassertechnologiekooperation durch das BMBF und das MOST gefördert (Förderkennzeichen 02WIL1387). Die Autoren bedanken sich herzlich bei Ramona Pfänder und Marina Ohlig für die hervorragende technische Unterstützung.

AUTOREN
Sebastian Buchinger
Carolin Riegraf
Georg Reifferscheid
Bundesanstalt für Gewässerkunde, Koblenz

Literatur:

[1] Schoenborn, A., et al., Unprecedented sensitivity of the planar yeast estrogen screen by using a spray-on technology. J Chromatogr A, 2017. 1530: p. 185-191.

[2] McDonnell, D.P., et al., High level expression of biologically active estrogen receptor in Saccharomyces cerevisiae. J Steroid Biochem Mol Biol, 1991. 39(3): p. 291-7.

[3] Cimpoiu, C., A. Hosu, and S. Hodisan, Analysis of some steroids by thin-layer chromatography using optimum mobile phases. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006. 41(2): p. 633-637.

[4] Purvis, I.J., et al., An androgen-inducible expression system for Saccharomyces cerevisiae. Gene, 1991. 106(1): p. 35-42.

[5] Riegraf, C., et al., Combination of yeast-based in vitro screens with high-performance thin-layer chromatography as a novel tool for the detection of hormonal and dioxin-like compounds. Analytica Chimica Acta, 2019. 1081: p. 218-230.

[6] Shakibai, D., et al., Coupling High-Performance Thin-Layer Chromatography with Bacterial Genotoxicity Bioreporters. Environmental Science & Technology, 2019. 53(11): p. 6410-6419.

[7] Schulz, W., et al., The reciprocal iso-inhibition volume concept: A procedure for the evaluation in effect-directed analysis with thin-layer chromatography – using the thin-layer chromatography-luminescent bacteria assay as an example. Journal of Chromatography A, 2017. 1519: p. 121-130.

[8] Stutz, L., et al., Selective two-dimensional effect-directed analysis with thin-layer chromatography. Journal of Chromatography A, 2017. 1524: p. 273-282.

[9] Minar, Y.A. and B. Spangenberg, Two-Dimensional Thin-Layer Chromatography of Phytoestrogens on RP-18 W Plate, Detected by Effect-Directed Analysis Using the Yeast Estrogen Screen Test. Jpc-Journal of Planar Chromatography-Modern Tlc, 2017. 30(5): p. 423-428.

[10] Klingelhofer, I. and G.E. Morlock, Sharp-bounded zones link to the effect in planar chromatography-bioassay-mass spectrometry. J Chromatogr A, 2014. 1360: p. 288-95.

[11] Riegraf, C., Reifferscheid, G., Becker, B., Belkin, S., Hollert, H., Feiler, U., & Buchinger, S. (2019), Detection and quantification of photosystem II inhibitors using the freshwater alga Desmodesmus subspicatus in combination with high-performance thin-layer chromatography. Environmental science & technology.

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