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Schlauch-ProzesspumpenProblemloses Upscaling bei biopharmazeutischen Projekten

Schlauch-Prozesspumpen: Problemloses Upscaling bei biopharmazeutischen Projekten

Die Firma Watson-Marlow hat ihr Angebot an hygienischen Gehäuseschlauchpumpen für Upstream- und Downstream-Prozesse in der Bioprozesstechnik erweitert. Die bereits verfügbaren Gehäusepumpenmodelle 120 und 530 werden durch die Modelle 630 und 730 für größere Fördermengen ergänzt, die Fördermengen von maximal 19 bzw. 55 l/min bieten.

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Falsch-negative Analysenergebnisse bei Früchten möglichNoroviren in Lebensmitteln

Laut Robert-Koch-Institut wurden in Deutschland in den Jahren 2011 und 2012 jeweils rund 100 000 Fälle von Norovirus-Erkrankungen gemeldet. Ihre Zahl liegt damit weit über Campylobacter- oder Salmonelleninfektionen. Auch für 2013 ist mit ähnlichen Werten zu rechnen.

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Lebensmittel

Ende September 2013 kam es zu einer Massenerkrankung von Schülern an einer Grundschule in Berlin-Prenzlauer Berg. Viele Infektionen sind dabei auf kontaminierte Lebensmittel zurückzuführen: Beim deutschlandweit bisher größten lebensmittelbedingten Ausbruch erkrankten 2012 etwa 11 000 Kinder und Jugendliche an Gastroenteritis, ausgelöst durch eine kontaminierte Charge Tiefkühlerdbeeren aus China. Um derartige Epidemien in Zukunft vermeiden und eine Kontamination der eigenen Ware rechtzeitig feststellen zu können, lassen viele Lebensmittelproduzenten und -händler in Laboren Proben auf den Erreger untersuchen. Doch die Analysenergebnisse sind nicht immer zuverlässig, wie eine laborinterne Untersuchung des Lebensmittellabors LADR zeigt: Bei weichen Früchten müssen 10 000 ... 100 000 Erreger pro Ansatz vorhanden sein, damit das Virus nachgewiesen werden kann - eine erhebliche Konzentration, die in kontaminierten Proben vermutlich nur selten erreicht wird. Besonders bei einer geringen Zahl von Untersuchungen pro Charge und ungleicher Verteilung der Noroviren auf den Früchten sind falsch-negative Resultate möglich.

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Noroviren lösen akute Gastroenteritiden mit schwallartigem, heftigen Erbrechen und starken Durchfällen aus. "Auf Lebensmittel können die Erreger vor allem über Kontaminationen durch eine unzureichende Hygiene Erkrankter gelangen, zum Beispiel über Hände und Oberflächen während Ernte, Bearbeitung oder Zubereitung", erklärt Dr. Burkhard Schütze, Leiter des Bereichs Lebensmittelanalytik bei der LADR GmbH in Geesthacht. Somit können alle Lebensmittel betroffen sein; besonders gefährdet sind jedoch solche, die roh verzehrt werden wie beispielsweise Salat, Sprossen, Gemüse und Früchte. Die Verunreinigung mit den Erregern kann auch, wie vermutlich bei dem Ausbruch 2012, auf einen Kontakt mit kontaminiertem Abwasser zurückzuführen sein. Vermehren können sich Noroviren auf oder in Lebensmitteln nicht, da Menschen die einzigen Wirte des Erregers sind. Allerdings reichen mitunter bereits 10 ... 100 Viruspartikel aus, um eine Erkrankung zu verursachen.

Hohe Anforderungen an Diagnostik
Zum Nachweis von Noroviren in Lebensmitteln gibt es verschiedene amtliche Verfahren, die im Wesentlichen aus drei Schritten bestehen: der Virus-Extraktion, der RNA-Extraktion und der Real-time-PCR. Die Nachweisverfahren unterscheiden sich dabei in erster Linie in der Virus-Extraktion. Da sich Noroviren nicht wie Bakterien anreichern lassen, sondern von den entsprechenden Matrix-Oberflächen abgespült und aufwendig aufkonzentriert werden müssen, stellt ihr Nachweis auf Lebensmitteln jedoch besondere Anforderungen an die Diagnostik im Labor. "Zur Virus-Extraktion setzen wir bei LADR zurzeit zwei verschiedene, sehr arbeitsaufwändige Methoden ein, die PEG-Präzipitations- und die Ultrafiltrationsmethode mit Zentrifugalkonzentratoren", erläutert Schütze. Erstere kommt bei weichen Früchten wie Erdbeeren im Rahmen des "Horizontalen Verfahrens zum Nachweis von Hepatitis-A-Viren und Noroviren in Lebensmitteln mittels Real-time-RT-PCR gemäß ISO/TS 15216-2 zum Einsatz," letztere beim "Qualitativen Nachweis von Noroviren der Genogruppen I und II auf glatten, festen Oberflächen durch Realtime Realtime-PCR" nach § 64 LFGB, L 00.00-112, beim Nachweis in geriebenen Möhren nach § 64 LFGB 25.04.01 sowie in angesäuerten Milchprodukten nach § 64 LFGB 02.00-35.

LADR-Studie

Feste Oberflächen werden mittels Tupfer abgestrichen und diese anschließend in 1 ml Lysispuffer ausgedrückt. Lebensmittel, die keine glatte, feste Oberfläche aufweisen, wie tiefgefrorene Himbeeren, Erdbeeren oder geriebene Möhren, werden mit steriler Flüssigkeit abgespült. Bei angesäuerten Milchprodukten sind dies 5 ml PBS-Puffer auf eine 5-g-Probe, bei geriebenen Möhren 7 ml.

Die zu untersuchenden Lebensmittel werden niemals homogenisiert, da dies die Untersuchung erheblich beeinflussen könnte. Die Spülflüssigkeit wird anschließend gefiltert und in besonderen Zentrifugationsverfahren aufkonzentriert. Dabei bleibt ein Retentatrest zurück, der nachfolgend molekularbiologisch auf Noroviren der Gruppen GG I und GG II untersucht wird. Bei weichen Früchten, Gemüse oder Salat wird gemäß ISO/TS 15216-2 eine 25-g-Probe genommen und mit 40 ml TGBE-Puffer 20 min lang abgespült. Dann wird der pH-Wert eingestellt und eine 30-minütige Zentrifugation mit 10 000 x g durchgeführt. Anschließend wird PEG beziehungsweise NaCl zugegeben, es erfolgt eine zweite Zentrifugation, und das dadurch entstandene Pellet wird mit Chloroform bzw. Butanol gewaschen. Daraufhin kann auch hier der zweite Verfahrensschritt, die RNA-Extraktion, eingeleitet werden, auf die dann eine Realtime-PCR folgt.

Sicheres Ergebnis nur bei hoher Viruskonzentration
Problematisch bei diesen Nachweisverfahren ist zum einen, dass zur Überwachung aller Arbeitsschritte von Anfang an eine sogenannte Prozesskontrolle mitgeführt werden muss. Bei der Ultrafiltrationsmethode wird eine MS2-Phagen-Suspension verwendet, deren Herstellung sehr arbeitsaufwändig ist, bei der PEGPräzipitationsmethode ist entsprechend der Vorschrift der Einsatz von Mengoviren vorgeschrieben, deren Beschaffung wiederum mit erheblichen Kosten verbunden ist. In beiden Fällen müssen diese Viren im Präzipitat beziehungsweise im Retentat nachweisbar sein.

Lebensmittelproben

Zum anderen besteht bei der Analyse von Lebensmittelproben auf Viren die Gefahr von falsch-negativen Ergebnissen, wie die Experten von LADR in einer laborinternen Untersuchung feststellten. "Wir wollten die Frage klären, wie viele Noroviren in einer Probe vorhanden sein müssen, um die Erreger überhaupt nachweisen zu können. Dazu gab es bislang noch keine Daten", so Schütze. "In unserem medizinischen Labor werden routinemäßig Stuhluntersuchungen auf Noroviren durchgeführt. Wir haben die Lebensmittelmatrices, die in unserem Labor häufig auf Noroviren untersucht werden, wie tiefgefrorene Erdbeeren, Himbeeren, Mangowürfel und Melonenbällchen, mit definierten Konzentrationen Noroviren aus diesen Stuhlproben beimpft und mit beiden Methoden, PEG-Präzipitation und Ultrafiltration, analysiert." Dabei stellten die Wissenschaftler fest, dass trotz einer theoretischen Nachweismöglichkeit von 2,0 x 102 Norovirus-Kopien/ml mittels RTPCR in der Praxis bei den angewandten unterschiedlichen Methoden eine erhebliche Konzentration von 1,0 x 104 bis 1,0 x 106 Noroviruskopien pro Ansatz vorhanden sein muss, um diese überhaupt feststellen zu können. Der Nachweis von Noroviren hängt demnach von der Anzahl vorhandener Erreger, ihrer Elution und Konzentration sowie der RNA-Extraktion ab. "Die Nachweisverfahren sind am besten für solche Lebensmittel geeignet, bei denen von einer hohen und gleichmäßigen Virenkontamination auszugehen ist. Diese Vermutung liegt bei Produkten mit langer, internationaler Produktionskette oder bestimmten Herkunftsländern nahe, bei denen man bereits von Problemen mit kontaminiertem Wasser oder Ähnlichem weiß", so Schütze.

Bei weichen Früchten ist der Nachweis von Noroviren besonders schwierig. Hier werden nur 25-g-Proben untersucht - bei Erdbeeren sind das nur etwa zwei ganze Früchte. "Befinden sich in dem 2-kg-Beutel, aus dem die Probe entnommen wird, nur wenige Erreger und sind diese zugleich auch noch ungleichmäßig verteilt, ist die Wahrscheinlichkeit, Viren festzustellen, besonders gering", erklärt Schütze. "Es kann passieren, dass gerade die belasteten Erdbeeren im Beutel verbleiben." Eine geringe Anzahl von Untersuchungen pro Charge und eine Heterogenität der Verteilung von Noroviren auf den Früchten könnte also zu falsch-negativen Resultaten führen. "Insbesondere im Rahmen von Eigenkontrolluntersuchungen ist das möglich", so Schütze. Gleichzeitig reicht unter Umständen jedoch eine einzige kontaminierte Frucht aus, damit sich der Verbraucher infiziert.

Spülflüssigkeit

Entsprechend Tabelle 1 müssten sich auf zu untersuchenden Erdbeeren 1,0 x 106 Noroviren befinden, um diese mittels Ultrafiltration nachzuweisen. Die PEG-Präzipitation ist nahezu 100-mal empfindlicher. Der Test auf Noroviren an tiefgekühlten Erdbeeren und Himbeeren sollte dementsprechend mit diesem Nachweisverfahren durchgeführt werden. Für den Norovirus-Nachweis auf diesen beiden Fruchtsorten ist die Ultrafiltration nach Einschätzung der Experten von LADR ungeeignet, da sich insbesondere die Gewinnung des Retentats als nicht unwesentlicher Faktor darstellt. Der Zustand der zu untersuchenden Früchte - frisch, tiefgefroren, angetaut, beschädigt oder ähnliches - ist hier besonders entscheidend. Bei tiefgefrorenen Mangostücken und Melonenbällchen ist der weniger arbeitsaufwändige Einsatz der Ultrafiltration im Labor möglich.

Einhaltung von Hygienestandards notwendig
Es sollten daher regelmäßige Oberflächen-Untersuchungen im Betrieb erfolgen sowie einmal im Jahr eine Stuhluntersuchung der Mitarbeiter durchgeführt werden, da es auch Norovirus-Dauerausscheider gibt. Hier sind deutlich höhere Erreger-Konzentrationen zu erwarten als bei Lebensmitteln, so dass die Testergebnisse zuverlässiger sind: "Für den Nachweis von Noroviren im Stuhl stehen in unserem Labor derzeit zwei verschiedene Methoden zur Verfügung, die Real-time-PCR und der Nachweis viraler Proteine mittels Antigen-EIA", erläutert Schütze. Bei Norovirus-Erkrankten können meist mehr als 1010 Noroviruskopien/g Stuhl vorkommen. "Neben dem molekularen Norovirus-RNA-Nachweis kommt ein Antigen-EIA in der Routine zur Anwendung. Insbesondere bei Häufungen von Durchfall und Erbrechen in Gemeinschaftseinrichtungen, Krankenhäusern und Altenheimen muss frühzeitig eine Diagnose angestrebt werden", so der Experte. Da ein Großteil der Kontaminationen auf mangelnde Personal- bzw. Handhygiene von Erkrankten und Dauerausscheidern zurückzuführen ist, muss gleichzeitig in jedem Fall auf die Einhaltung höchster Hygienestandards geachtet werden.

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