Neue Säulenoption für die U/HPLC

Dr. Ulrike Jegle*)

1. Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland, E-Mail: Ulrike_Jegle@Agilent.com
   

Poroshell-120-Partikel (2,7 µm) besitzen einen nicht-porösen, undurchlässigen Kern von 1,7 µm, auf den in einem einzigen Prozessschritt eine poröse Schicht (Shell – 0,5 µm) aufgebracht wird (Bild 1). Sowohl der Kern als auch die poröse Schicht bestehen aus ultra-reinem und mechanisch extrem stabilem Kieselgel. Die Porengröße von 120 Angstrom macht die Phasen optimal einsetzbar für kleine Moleküle (pharmazeutische Wirkstoffe, Feinchemikalien, Pestizide, etc.) bis hin zu kleinen und mittleren Peptiden (Peptide Maps).

Die signifikant hohe Trenneffizienz bzw. Bodenzahl dieser 2,7 µm großen Partikel lässt sich durch die folgenden zwei Effekte erklären:

1. Optimierung des Massentransfers bei der Wechselwirkung des Probenmoleküls auf der Oberfläche der Umkehrphasen.

2. Reduktion der Mehrwegsdiffusion in der Säulenpackung.

Die dünne adressierbare, poröse Schicht, die den zu trennenden Probenmolekülen statt eines gesamten Partikels mit porösem Aufbau angeboten wird, sorgt für eine deutliche Reduktion des Diffusionsweges der Moleküle und reduziert damit die Zeit, die die Moleküle benötigen, um wieder zurück in den fließenden Eluenten zu gelangen. Dies reduziert die Peakverbreiterung und erhöht damit die Bodenzahl.

Teilporöse Partikel können mit deutlich engerer Partikelgrößenverteilung produziert werden, als dies für total poröse Materialien generell möglich ist. Damit lässt sich eine deutlich bessere Säulenpackung erzielen und Bandenverbreiterung der Peaks im Säulenbett selbst minimieren. Das Resultat sind Trenneffizienzen, die bei ca. 90 % der Sub-2-micron-Partikel liegen, aber bei deutlich geringerem Säulenrückdruck.

Poroshell-120-Phasen sind momentan in drei verschiedenen Selektivitätsoptionen verfügbar:
1. Poroshell 120 EC C18.
2. Poroshell 120 EC C8.
3. Poroshell 120 StableBond C18.

Die physikalischen Daten der stationären Phasen sind in Tabelle 1 dokumentiert. Weitere Selektivitätsoptionen sind geplant.

Beladbarkeit

Die Beladbarkeit einer stationären Phase ist nicht nur in der präparativen Analytik gefragt, sondern auch im analytischen Bereich, denn Sie bestimmt die Linearität und den dynamischen Bereich einer Säule. In der Praxis heißt das, bis zu welcher Konzentration kleine Verunreinigungen neben hochkonzentrierten Hauptkomponenten nachgewiesen werden können.

Die Peakbreite einer Komponente wird als Indikator für die Beladbarkeit eingesetzt. Eine Säule ist dann überladen, wenn die Peakbreite in Abhängigkeit einer steigenden Injektionsmenge beginnt, größer zu werden. Die Bilder 3 und 4 zeigen, dass die Beladbarkeit der teilporösen Poroshell 120 vergleichbar der Beladbarkeit der klassischen, total porösen Materialien ist. Damit sind die Säulen unter identischen Bedingungen einsetzbar wie ihre total porösen Pendants.

Methodentransfer

Ein klassisches Beispiel für eine Methode zur Trennung von pharmazeutischen Wirkstoffen auf einer ZORBAX Eclispe Plus C18, 4,6 x 250 mm, gepackt mit total porösen 5 µm Partikeln, ist in Chromatogramm 1 dargestellt. Soll diese Methode auf U/HPLC übertragen oder eine neue Methode entwickelt werden, lässt sich das identische Trennergebnis unter Beibehaltung der Auflösung mit der neuen Poroshell 120 Phase EC C18 ohne spezielle Optimierungsmaßnahmen mit einer Säulendimension von 4,6 x 100 mm erzielen, also lediglich mit einer Längenreduktion. Die Auflösung des kritischen Peakpaares bleibt erhalten. Die Analysenzeit verkürzt sich signifikant von 30 Minuten auf 12 Minuten. Schrittweise Erhöhung der Flussrate unter Anpassung der Gradientensteilheit führen zu weiteren Analysenzeitreduktionen, bis zu letztlich weniger als 6 Minuten – weiterhin unter Erhalt der Auflösung.

Neben der Erhöhung der Flussrate sollten weitere Optimierungsschritte berücksichtigt werden, um die in der Säule erzielte Trenneffizienz bis zum Detektor aufrecht erhalten zu können:

• Das Injektionsvolumen muss dem kleiner gewordenen Säulenvolumen angepasst werden und wie hier beispielhaft gezeigt von 5 µl auf 2 µl reduziert werden.
• Verzögerungs- und Dispersionsvolumen wie Verbindungskapillaren und Detektionszellen z.B. müssen minimiert werden, um Bandenverbreiterung außerhalb und insbesondere nach der Säule zu minimieren.
• Die Datenrate des Detektors muss aufgrund der kleinen Peakbreite (und damit hohen Trenneffizienz) erhöht werden, um sicherzustellen, dass der Peak durch genügend viele Datenpunkte aufgezeichnet wird.
  

Für UHPLC ausgelegte Instrumentierungen wie das Agilent 1290 Infinity LC-System integrieren bereits die beschrieben instrumentellen Optimierungen in der Standardausführung.

Fazit

Teilporöse Poroshell-120-Säulen sind in verschiedensten Applikationsbereichen der HPLC und UHPLC einsetzbar. Sie sind aufgrund ihres geringen Rückdrucks der ideale Partner für schnelle Chromatographie auf 400-bar-LC-Systemen und bieten in Kombination mit UHPLC-LC-Systemen mit ausgedehnten Druckbereichen (600 und 1200 bar) sowohl optimale Geschwindigkeit als auch maximale Trenneffizienz – selbst 250 mm lange Säulen von bis zu 80000 Böden/Meter sind nicht nur denkbar, sondern produzier- und einsetzbar.