Die MALDI- TOF-Massenspektrometrie

Die Methode ist sehr empfindlich, ihre Nachweisgrenze liegt im pmol-Bereich und sogar weiter darunter. Das bedeutet, dass die Nachweisgrenze sich – absolut betrachtet – für ein Probevolumen von 2 µl bei der durchaus vorstellbaren Zahl von ungefähr 120…1200 Molekülen befindet (unter Berücksichtigung der Avogadro-Konstante (= Loschmidt‘sche Zahl), die besagt, dass 1 mol eines Stoffes 6,02252 x 10²³ Teilchen enthält).

Die MALDI-TOF-MS dient jedoch in erster Linie nicht der Quantifizierung von Substanzen, sondern kann hervorragend zur Strukturaufklärung komplexer Biomoleküle, zur Proteomanalytik, zur Genotypisierung oder auch zur Identifizierung von Mikroorganismen eingesetzt werden.

Zur Geschichte der Massenspektrometrie

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Eine der ersten Anwendungen der Massenspektrometrie bestand in der Trennung von Isotopen einer Atomspezies. Tatsächlich findet die Massenspektrometrie schon seit Langem praktische Anwendung in der Lebensmittelanalytik, unter anderem zum Nachweis unerwünschter Zusätze. Mitte des vorigen Jahrhunderts wurden Wein und Honig zum Beispiel durch den Zusatz von Rohrzucker nachträglich gesüßt. Rohrzucker kann aufgrund des Verhältnisses der Kohlenstoffisotope ¹³C und ¹²C (δ¹³C/¹²C [‰]) von dem natürlicherweise in Wein und Honig enthaltenen Zucker unterschieden werden (s. Infokasten „Isotopendiskriminierung“).

Seit in den 1990er Jahren schonende Ionisierungsmethoden für das biologische Untersuchungsgut entwickelt wurden, hat sich das Anwendungsgebiet der Massenspektrometrie auf komplexe Biomoleküle ausgeweitet. Mittlerweile werden nahezu alle Biomoleküle – DNA, Proteine, Peptide, niedermolekulare Metabolite, Kohlenhydrate, Lipide und Hormone – mit Hilfe der Massenspektrometrie analysiert. 2002 wurde Koichi Tanaka für seine Arbeiten zur MALDI-Technik mit dem Chemie-Nobelpreis ausgezeichnet.

Die Methode

Die MALDI-TOF-Massenspektrometrie (s. Bild 1) eignet sich hervorragend als sogenannte Fingerprinting-Methode zur Identifizierung von Mikroorganismen, zur Proteomanalytik auf der Suche nach neuen Biomarkern oder zur Genotypisierung von Single-Nucleotid-Polymorphismen (SNP), Deletionen oder Insertionen.

Jede Substanzklasse erfordert eine individuelle Probenvorbereitung, speziell angepasste Messparameter und natürlich auch eine spezifische Software-gestützte Auswertung der Messergebnisse.

Grundsätzlich müssen die Moleküle des Untersuchungsgutes für die Massenspektrometrie als freie Ionen vorliegen. Zur Analyse von Biomolekülen ist eine besonders schonende Ionisierung erforderlich. Denn eine zu starke Ionisierung führt gleichzeitig zu einer Fragmentierung der zu analysierenden Moleküle, wodurch eine sinnvolle Auswertung der gemessenen Spektren stark erschwert, wenn nicht sogar unmöglich wird.

Zur Vorbereitung der Ionisierung wird das Analysengut mit einem mindestens tausendfachen molaren Überschuss einer organischen Substanz (Matrix) gemischt (s. Bild 2), die wiederum in einem organischen Lösungsmittel gelöst ist. Beim Verdunsten des Lösungsmittels kristallisieren die Moleküle des Analyten gemeinsam mit den Matrixmolekülen aus. Diese Kokristalle werden im Hochvakuum mit einem Laserstrahl beschossen. Die Matrixmoleküle absorbieren dabei den Großteil der Laserenergie. Dadurch wird sichergestellt, dass die Moleküle des Analysengutes zwar ionisiert, aber nur geringfügig defragmentiert werden.
Die in der Regel einfach geladenen Ionen werden in ein Vakuum freigesetzt und durch eine Beschleunigungselektrode im elektrischen Feld auf eine konstante Geschwindigkeit gebracht. Die Flugstrecke zwischen der Beschleunigungselektrode und dem Detektor ist nur vom Masse-Ladungsverhältnis abhängig und wird zur Bestimmung der molekularen Masse der jeweiligen Moleküle genutzt.

Die Bestimmung der Molekülmasse erfolgt durch die Bestimmung der Flugzeit (TOF = Time Of Flight) der Ionen, die nach Beendigung der Flugstrecke an einem Detektor entladen werden.

Die durch die MALDI-TOF-Massenspektrometrie gewonnenen Rohdaten werden einer automatisierten Datenanalyse unterzogen. Dabei werden die gemessenen Spektren geglättet und normalisiert. Ein Basisrauschen wird subtrahiert und die signifikantesten Peaks werden gesondert aufgelistet (s. Bild 4). Durch Vergleich mit bekannten Spektren können die Peaks dem Molekulargewicht zugeordnet werden. Je nach Anwendung werden entsprechende Algorithmen zur Datenanalyse eingesetzt.

Anwendungsbeispiele

Die Strukturaufklärung von Biomolekülen, die Identifizierung von Mikroorganismen, SNP-Analysen, Proteomanalysen, das alles sind Beispiele für die Anwendung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie.

Die Identifizierung von Mikroorganismen mit Hilfe der MALDI-TOF-MS wird mittlerweile bereits in der Routine eingesetzt. Ausgehend von einer Einzelkolonie, d.h. aus ganzen Zellen, können Bakterien und Sprosspilze bis zur Spezies bestimmt werden. Als Vergleichsbasis für den „Fingerprint“ dienen dabei die Muster kleiner ribosomaler Proteine mit einem Molekulargewicht zwischen 2 und 20 kDa.

Als Matrix für die Identifizierung von Mikroorganismen wird α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (Bild 2) eingesetzt. Zur Probenvorbereitung wird ein Teil einer einzelnen Bakterien- oder Pilzkolonie nach einer Vorreinigung auf einen Metallträger (s. Bild 3) aufgebracht und bei Zimmertemperatur getrocknet. Nach dem Trocknen wird jeder Spot des Untersuchungsgutes mit 2 µl der Matrix α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure überlagert (s. Bild 3). Nachdem das Lösungsmittel der Matrix verdunstet ist, kann die eigentliche Messung im MALDI-TOF-Massenspektrometer beginnen.

Dabei werden die Moleküle von 2…20 kDa detektiert. Die Auswertung der Spektren erfolgt im Vergleich mit einer Datenbank aus Massenspektren bekannter Mikroorganismen (Bild 4). Die Identifizierungsrate der Methode liegt bei deutlich über 90 %.

Ausblick

Die MALDI-TOF-Massenspektrometrie wird bereits in der Routine zur Identifizierung von Mikroorganismen eingesetzt. An der Optimierung der Methode beziehungsweise der Erweiterung der Fragestellung wird stetig gearbeitet. Eine Fragestellung, deren Klärung einen weiteren Meilenstein in der Medizinischen Mikrobiologie darstellt, ist die Typisierung von Bakterien zum Nachweis von Antibiotikaresistenzen. Die Typisierung ist bereits prinzipiell möglich, erfordert aber noch weiterführende Studien.

Danksagung
Ich danke Michaele Josten, MTLA am Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Parasitologie am Universitätsklinikum Bonn, für die ausführliche Einführung in die MALDI-TOF-Massenspektrometrie und die freundliche Überlassung des Bildmaterials.

Dr. Gabriele Egert*)

1. 26121 Oldenburg, E-Mail: kontakt@g-egert.de, http://www.g-egert.de