Neues PicoQuant-Modul für höchst flexible FLIM- und FCS-Analysen

Mit dem neuen PicoQuant-Modul lassen sich modernste FLIM-(Fluoreszenz-Lebensdauer-Mikroskopie-) und FCS-(Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie-)Verfahren durchführen. Es basiert auf zeitkorrelierter Einzel-Photonenzählung (TCSPC – Time Correlated Single Photon Counting) und verwendet die sogenannte Time-Tagged Time-Resolved (TTTR) Datenverarbeitung. Diese gilt als die präziseste Technik mit der höchsten zeitlichen Auflösung. Gepulste Diodenlaser von 375…900 nm mit regulierbarer Leistung erzeugen die nötigen Pikosekunden- oder Femtosekundenpulse. Die Mehrkanalversion kann ebenso eine gepulst-alternierende Anregung (Pulsed Interleaved Excitation oder PIE) ausführen. Dabei lassen sich bis zu vier gepulste Laser in einen einzigen Lichtleiter koppeln, so dass die Wechsel zwischen Wellenlängen oder simultane Laseranregungen ganz einfach vorzunehmen sind.

Die TCSPC-Datenerfassungseinheit hat eine sehr hohe zeitliche Auflösung von 4 ps. Aufgenommen werden die Daten über einen einzigartigen TTTR-Modus, der zu jedem detektierten Photon die zeitlichen Informationen speichert. Dadurch sind selbst offline sehr aufwendige Analysen möglich. Zwei verschiedene Detektortechnologien – jeweils als Ein- oder Zweikanalsystem verfügbar – sorgen für eine größere Flexibilität. PMTs eignen sich hervorragend für FLIM-Methoden, während spezielle Single-Photon Avalanche Diodes (SPADs) aufgrund ihrer höheren Detektionseffizienz ideal für FCS-Anwendungen sind. Darüber hinaus gibt es für Messungen, die eine hohe Detektionseffizienz verlangen, zwei verschiedene SPAD-Typen. Aufgrund dieser Detektoren besitzt das System die nötige Vielseitigkeit, um Fluoreszenz-Lebensdauern von weit unter 100 ps aufzulösen und – je nach Aufbau – FLIM-Experimente online auszuführen.

Sämtliche Komponenten der PicoQuant-Module werden mit der SymPho-Time-Software gesteuert. Das anwenderfreundliche Programm verfügt zur Erfassung, Verarbeitung und Analyse der Daten über leistungsstarke Prozesse, welche für die Maximierung der FCS- oder FLIM-Techniken erforderlich sind. Die Software unterstützt zudem etliche ähnliche Verfahren einschließlich Fluoreszenz-Lebensdauer-Korrelations-Spektroskopie (FLCS – Fluorescence Lifetime Correlation Spectroscopy), Fluoreszenz- (oder Förster-)Resonanz-Energie-Transfer (Fluorescence Resonance Energy Transfer oder FRET) und PIE-FRET.

FLIM

In der Fluoreszenzmikroskopie wird die Fluoreszenzintensität durch ein Falschfarbenbild dargestellt, während es beim FLIM die Fluoreszenz-Lebensdauer ist. Messungen können mit nur einem Detektor vorgenommen werden und sind von Fluktuationen in der Fluoreszenzintensität, verschiedenen Fluorophorkonzentrationen oder der Probendicke unbeeinträchtigt. Dadurch lassen sich oft tiefere strukturelle Erkenntnisse gewinnen. FLIM ermöglicht es, zwischen Fluorophoren mit ähnlichen Emissionsspektren wie beispielsweise GFP und YFP zu unterscheiden als auch spezifische Signale von Autofluoreszenz zu trennen. Darüber hinaus ist eine erfolgreiche Kombination mit Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) möglich. FLIM eignet sich folglich zur Bestimmung von: Sauerstoff-, Wasser- oder Ca²⁺-Konzentrationen, pH-Werten, Abständen im nm-Bereich, intrazellulären Signaltransduktionen sowie molekularen Strukturen und Dynamiken und weiteren Faktoren.

FCS

Mit der FCS lassen sich auf der Einzelmolekülebene molekulare Eigenschaften sowie Diffusionskonstanten und Konzentrationen in Lösungen messen. Es ist eine überaus präzise und vielseitige Methode, die ihr großes Potenzial bereits bei vielen verschiedenen Anwendungen bewiesen hat. Darüber hinaus kann sie für Lumineszenzsignale verwendet werden. Die Methode beruht auf Schwankungen in der Fluoreszenzintensität, verursacht durch einzelne Fluorophore im Anregungsvolumen, welche im zeitlichen Verlauf aufgezeichnet werden. Die Intensitätsschwankungen lassen sich hinsichtlich ihrer Stärke und Dauer mittels zeitlicher Autokorrelation der aufgenommenen Signalstärken quantifizieren.