DNA-Trennung im Mikrofluidikchip

DNA-Trennung im Mikrofluidikchip

Gel-freie Trennung von DNA nach Länge und Konformation

Dr. Jan Regtmeier*)

  1. Experimentelle Biophysik & Angewandte Nanowissenschaften, Fakultät für Physik, Universität Bielefeld, Universitätsstr. 25, 33615 Bielefeld. E-Mail: jan.regtmeier@physik.uni-bielefeld.de
Am Beispiel der Trennung von DNA nach Länge und Konformation wird im Folgenden gezeigt, dass ein Probenvolumen von ca. 60 pl (10-15 l) genügt, um verlässliche Aussagen über die Probenzusammensetzung und deren räumliche Konformation zu treffen, und zwar mit einer Analysezeit von weniger als 4 min. Als Plattform für die hier beschriebene Gel-freie Trennung dient ein Kunststoffmikrofluidikchip, der mit einem Array von Pfosten mikrostrukturiert ist. Unter Anlegen einer elektrischen Spannung erzeugen diese nicht-leitenden Pfosten ein inhomogenes elektrisches Feld. Gleichzeitig induziert das elektrische Feld einen Dipol in der DNA, der mit dem inhomogenen Feld wechselwirkt – ein Effekt namens Dielektrophorese. Diese markierungsfreie, nicht-invasive und zerstörungsfreie Methode erlaubt das Fangen von DNA und das Trennen sowohl nach Länge als auch nach Konformation [1, 2].
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Der Wunsch nach einer immer höheren Auflösung und Sensitivität gepaart mit dem Druck, Analysen schneller und kostengünstiger durchzuführen, haben die Mikrofluidik vorangetrieben [4, 5, 6, 7, 8, 9, 10]. Darunter versteht man miniaturisierte Kanalsysteme mit Dimensionen im Mikrometerbereich (typisch 1...100 µm Kanalbreite). Von Beginn an war die schnelle Trennung von DNA ein Thema, um bestehende Limitierungen durch die Standardtechniken (Plattengel- bzw. Kapillargelelektrophorese [11, 12, 13]) zu überkommen. Obwohl es sich bei letzterer bereits um eine miniaturisierte Variante der klassischen Plattengelektrophorese handelt, dauert eine Trennung immer noch ca. 30 min bei einem benötigten Probenvolumen von ca. 1 µl.

Die Idee basiert auf der Nutzung der Dielektrophorese. Dabei wird durch nichtleitende Hindernisse (sogenannte elektrodenlose Dielektrophorese, im Gegensatz zur klassischen Dielektrophorese mit Mikroelektroden, siehe Bild 1) ein inhomogenes elektrisches Feld erzeugt. Gleichzeitig induziert dieses elektrische Feld einen Dipol in der DNA (siehe Bild 2, wobei der genaue Polarisationsmechanismus weiterhin unklar ist [14, 15]). Dieser Dipol wechsel wirkt mit dem inhomogenen elektrischen Feld und wird dadurch einer dielektrophoretischen Kraft unterworfen:

→ →
F = α ∇ E2 (GL.1)

Dabei ist α die Polarisierbarkeit, E das elektrische Feld und F die dielektrophoretische Kraft. Hieran sieht man deutlich, dass homogene elektrische Felder keine dielektrophoretische Kraft ausüben. Eine Möglichkeit zur Erzeugung dielektrophoretischer Kräfte ist in Bild 3 gezeigt. Unter Anlegen einer Wechselspannung (AC) ist es damit möglich, DNA in einem Array von nicht-leitenden Pfosten zu fangen (Bild 3, Mitte).

Allerdings führt dieses Fangen allein noch nicht zu einer Trennung. Erstens gilt es noch zu zeigen, dass verschiedene DNA-Moleküle unterschiedliche Polarisierbarkeiten (α) aufweisen, da ansonsten kein Selektionskriterium zur Verfügung steht. Zum Zweiten ist für die selektive Trennung noch ein Transport der DNA durch das Pfostenarray notwendig. Dazu wird noch eine zusätzliche Gleichspannung (DC) angelegt.

Da die wissenschaftliche Literatur zum Teil widersprüchliche Werte bezüglich der Polarisierbarkeit von DNA liefert, haben wir zuerst die Polarisierbarkeiten verschiedener DNA-Fragmente mittels einer eigens entwickelten Methode quantitativ bestimmt [1, 2]. Dies lässt sich nun wie folgt für die Trennung nutzen: Es wird eine konstante DC-Spannung an das Pfostenarray angelegt, so dass die DNA-Mischung, bestehend aus zwei verschieden langen DNA-Fragmenten, durch das Array mittels Elektrophorese transportiert wird. Dieser DC-Spannung wird eine AC-Spannung überlagert, und zwar so, dass für die eine DNA-Spezies die dielektrophoretische Kraft stärker ist als die elektrophoretische Kraft, d.h. die DNA wird gefangen. Gleichzeitig muss aber gewährleistet sein, dass für die zweite DNA-Spezies die Elektrophorese überwiegt, so dass diese DNA durch das Array transportiert wird.

Softlithographie

Die Herstellung der Kunststoffchips basiert auf der Softlithographie [16]. Dabei wird ein strukturierter Siliziumwafer mittels Poly(dimethylsiloxan) (PDMS) abgeformt, d.h. das flüssige Elastomer wird über den Wafer gegossen und ausgehärtet (siehe Bild 4). Dann wird das PDMS abgezogen, zugeschnitten und mit der strukturierten Seite nach unten auf ein Deckglas aufgelegt. Der Vorteil liegt darin, dass kostengünstig und schnell neue Prototypen hergestellt werden. PDMS ist ein günstiges Elastomer, das transparent und biokompatibel ist.

Um die DNA visuell verfolgen zu können, ist diese mit dem Farbstoff YOYO-1 markiert. Diese Fluoreszenzmarkierung ist einzig für die visuelle Kontrolle notwendig und nicht für die eigentliche dielektrophoretische Trennung.

Ergebnisse & Diskussion

Wie oben beschrieben, basiert die hier vorgestellte Methode auf der geeigneten Kombination von AC- und DC-Spannungen, so dass eine DNA-Sorte selektiv mittels Dielektrophorese gefangen und die andere weiter transportiert wird. Dass dies prinzipiell möglich ist, demonstriert Bild 5a. Dort ist die Trennung von sehr langen DNA-Fragmenten (48,5 kbp und 164 kbp) innerhalb von weniger als 4 min gezeigt. Interessant ist ein Vergleich der erzielten Trennzeit zur Standardtechnik der gepulsten Gelelektrophorese, die zur Trennung solch langer Fragmente notwendig ist: Diese hat 24 h gedauert.

Dass sich mit der vorgestellten Methode auch kürzere DNA-Fragmente schnell trennen lassen, demonstriert Bild 5b. Dort ist die Trennung superspiralisierter DNA (7 und 14 kbp) gezeigt. Die DNA ist in sich verwunden und zu einem geschlossenen Kreis verknüpft. Diese Trennung benötigt ebenfalls weniger als 4 min, eine deutliche Verbesserung im Vergleich zur Kapillargelelektrophorese mit 30 min. Da unsere Methode sowohl lineare als auch superspiralisierte DNA zu trennen vermag, kam die Frage auf, ob auch DNA-Fragmente mit identischer Anzahl an Basenpaaren, aber unterschiedlicher Konformation (linear gegenüber superspiralisiert) sich mit dieser neuen Methode ebenfalls trennen lassen. Der proof-of-principle ist in Bild 5c gezeigt.

Fazit & Ausblick

Hier wurde die Trennung von DNA nach Konformation und Länge innerhalb von weniger als 4 Minuten in einem mikrostrukturierten Pfostenarray gezeigt. Dabei wurde ein 60-pl-Volumen mit einer DNA-Konzentration von 20 pM analysiert.

Für die Zukunft sehen wir sogenannte kontinuierliche Trennverfahren als sehr vielversprechend. Dabei wird nicht wie bislang ein definiertes Volumen injiziert und analysiert, sondern die Probe kontinuierlich zugeführt. Dies erlaubt deutliche Fortschritte für die präparative Analytik und ermöglicht die Einstellung und Optimierung von Parametern in Echtzeit während des laufenden Experiments. Zudem könnte die weitere Verkleinerung der Chips dazu führen, dass auch Proteine mittels Dielektrophorese getrennt und analysiert werden könnten.


Danksagung

Die diesem Beitrag zugrunde liegenden Forschungsarbeiten wurden im Rahmen einer sehr erfolgreichen Kooperation im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 613 (finanziert durch die DFG) erzielt. Daher danke ich Professor Anselmetti für seine langjährige Unterstützung und Förderung, Herrn Bogunovic und Herrn Hellmich-Duong für die sehr gute Zusammenarbeit, Alexandra Ros für ihr Mitwirken und Professor Eichhorn für die langjährige erfolgreiche Kooperation.

Literatur

  1. J. Regtmeier, T. T. Duong, R. Eichhorn, D. Anselmetti, A. Ros, Anal. Chem. 2007, 79, 3925–3932.
  2. J. Regtmeier, R. Eichhorn, L. Bogunovic, A. Ros, D. Anselmetti, Anal. Chem. 2010, 82, 7141–7149.
  3. G. M. Whitesides, Nature 2006, 442(7101), 368–373, doi: 10.1038/nature05058.
  4. D. Reyes, D. Iossifidis, P. Auroux, A. Manz, Anal. Chem. 2002, 74, 2623–2636.
    [5] P. Auroux, D. Iossifidis, D. Reyes, A. Manz, Anal. Chem. 2002, 74, 2637–2652.
  5. T. Vilkner, D. Janasek, A. Manz, Anal. Chem. 2004, 76, 3373–3386.
  6. P. Dittrich, K. Tachikawa, A. Manz, Anal. Chem. 2006, 78, 3887–3908, doi: 10.1021/ac0605602.
  7. J. West, M. Becker, S. Tombrink, A. Manz, Anal Chem 2008, 80(12), 4403–4419, doi: 10.1021/ac800680j.
  8. A. Arora, G. Simone, G. B. Salieb-Beugelaar, J. T. Kim, A. Manz, Anal Chem 2010, 82(12), 4830–4847, doi: 10.1021/ac100969k.
  9. L. Y. Yeo, H.-C. Chang, P. P. Y. Chan, J. R. Friend, Small 2010, doi: 10.1002/smll.201000946.
  10. J. Tegenfeldt, C. Prinz, H. Cao, R. Huang, R. Austin, S. Chou, E. Cox, J. Sturm, Anal Bioanal Chem 2004, 378, 1678.
  11. S. Kuhn, Capillary Electrophoresis:Principles and Practice, Springer, 1993.
  12. J. Viovy, Rev Mod Phys 2000, 72, 813–872.
  13. D. Porschke, J Biophys Chem 1997, 66, 241–257.
  14. R. Hölzel, IET Nanobiotechnol 2009, 3, 28–45.
  15. Y. Xia, G. Whitesides, Annu. Rev. Mater. Sci. 1998, 28, 153–184.
  16. H. Pohl, Dielectrophoresis: The Behavior of Neutral Matter in Nonuniform Electric Fields, Cambridge University Press, 1978.
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