Multiphotonenmikroskopie

Tiefe Einsichten ins Leben

SP8 DIVE – Neue Wege in der Multiphotonenmikroskopie bei Anregung und Nachweis. Das Multiphotonenmikroskop SP8 DIVE (Deep In Vivo Explorer) enthält einige Neuentwicklungen für nichtlineare Mikroskopie, mit denen insbesondere die spektrale Auswahl bei Mehrfach-Färbungen wesentlich einfacher und effizienter gelingt.

Bild 1: Das Bild zeigt Darmkrebszellen. Sie sind mit einem Multi-Parameter-System zur Abstammungsverfolgung (Lineage Tracing) angefärbt. In Grau erscheint das Kollagen 1, sichtbar gemacht durch SHG (Second Harmonics Generation). Die Emission der Fluoreszenzmarker ist in Magenta, Blau, Grün, Gelb und Rot dargestellt. Alle Kanäle wurden mit Zwei-Photonen-Anregung in einem SP8 DIVE aufgezeichnet. Mit diesem Gerät lassen sich die einzelnen Detektionsbanden für die Emissionen kontinuierlich und ohne mechanischen Filterwechsel einstellen. Präparat und Aufnahme: J. van Rheenen, H. Snippert (Utrecht, Niederlande) und I. Steinmetz (Leica Mannheim)

Lebendiges steht der mikroskopischen Untersuchung nur selten in dünnen Präparaten zur Verfügung. Man muss daher in der Regel durch eine dickere Schicht tief in das Objekt hineinschauen. Dabei stört das darüberliegende Gewebe als stark streuendes „trübes“ Material. Nichtlineare Anregung der Fluoreszenz schafft hier Abhilfe. Das Multiphotonenmikroskop SP8 DIVE (Deep In Vivo Explorer) von Leica enthält einige Neuentwicklungen für nichtlineare Mikroskopie, mit denen insbesondere die spektrale Auswahl bei Mehrfach-Färbungen wesentlich einfacher und effizienter gelingt. Der folgende Beitrag gibt eine kurze Einführung in die Multiphotonenmikroskopie, erläutert eine Methode zur effizienten und fehlerfreien Beleuchtung mit mehreren IR-Lasern und beschreibt zum Schluss eine neuartige Einrichtung (4Tune), die es auch für Non-descanning-Detektoren erlaubt, kontinuierlich einstellbare spektrale Bänder auszuwählen.

Multiphotonen-Mikroskopie
Die Streuung nimmt mit der vierten Potenz der Wellenlänge ab (das gilt streng genommen nur für Rayleigh-Streuung). Darum benutzt man möglichst große Wellenlängen (etwa Infrarotlicht) zur Anregung. In grober Näherung wird somit bei einer Verdoppelung der Wellenlänge das Präparat sechzehnmal durchsichtiger. (In der Astronomie macht man sich das durch Infrarot-Teleskope zunutze, mit denen man durch dichten interstellaren Staub beispielsweise unser galaktisches Zentrum beobachten kann.) Die meisten Fluoreszenzfarbstoffe absorbieren jedoch im kürzerwelligen Bereich – oft im ultravioletten bis blauen Teil des Spektrums. Um diese Farbstoffe mit längerwelligem Licht anzuregen, kann man die Anregungs-energie statt in einem einzigen Photon hoher Energie (z.B. grün) in zwei oder mehr Teillieferungen von Photonen niedrigerer Energie bereitstellen. Etwa zwei Photonen der halben Energie (nahes Infrarot).

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Bild 2: Rekonstruierter Stapel optischer Schnitte aus einem Multiphotonenmikroskop über knapp 1mm Tiefe. Patella-Gewebe mit grün dargestellten Chondrozyten: Fluoreszenz aus GFP und dem SHG-Signal des Kollagens: graue Matrix. (Aufnahme I. Steinmetz, Leica Mannheim)

Dass solch ein Multiphotonen-Prozess möglich ist, hat Maria Göppert-Meyer bereits 1931 in ihrer Doktorarbeit postuliert [1].Die Sache hat allerdings einen Haken: Um ein Molekül mit zwei separaten Photonen anregen zu können, müssen diese zwei Photonen gleichzeitig mit dem Molekül wechselwirken. Das kritische Wort ist hier „gleichzeitig“. Etwa innerhalb von 10–18 Sekunden müssen die beiden Photonen am Molekül ankommen. Eine hinreichende Ausbeute erhält man deshalb nur, wenn sehr viele Photonen vorhanden sind, die Intensität des beleuchtenden Lichtes also sehr hoch ist. Sehr hohe Leistungen liefern Laser mit kurzen Pulsen.

Die Intensität und damit die „Konzentration“ der Photonen ist aber auch von der Fläche abhängig, die bestrahlt wird. Um die Intensität zu maximieren, wird in einem Multiphotonen-Mikroskop das Licht auf einen beugungsbegrenzten Fleck fokussiert. Um ein zweidimensionales Bild zu erhalten, muss dieser Fleck über das Präparat gerastert werden, ähnlich dem Elektronenstrahl in einer altmodischen Fernsehröhre des vergangenen Jahrtausends. So ein Punkt-Rasterverfahren wird bei „echten“ konfokalen Mikroskopen eingesetzt, also bei Geräten, die nur einen Punkt zu jeder Zeit beleuchten (TCS: true confocal scanner). Deshalb sind Multiphotonen-Mikroskope in der Regel Derivate konfokaler Mikroskope [2].

Nachdem nun sehr viel Aufwand in solch ein Mikroskop gesteckt wurde, erhält man eine wichtige Eigenschaft als „Belohnung“: Da die Anregung nicht linear erfolgt, sondern nur dort, wo die Photonendichte sehr hoch ist, wird nur in einer dünnen Schicht um die Fokus- ebene herum angeregt. Nur aus dieser Schicht erhält man Fluoreszenz-Emission (respektive höhere Ordnungen bei nichtlinearer Streuung). Das Ergebnis ist ein optischer Schnitt – wie bei einem konfokalen Mikroskop, aber ohne Raumfilter (Pinhole). Wegen der großen Wellenlänge kann dieser Schnitt aber viel tiefer im Präparat liegen.

Bild 3: Ungefärbter Gewebeschnitt aus einer Maus. Rot: SHG-Signal von Bindegewebsfasern. Grün: Eigenfluoreszenz der Muskulatur. Blau: THG-Signal von den Grenzflächen der Lipidstrukturen. (Aufnahme: Z. Jiang, Leica Mannheim)

Neben Fluoreszenz kann man mit solch einem Gerät auch nichtlineare Streuung sichtbar machen, also Effekte, wie sie als Frequenzverdoppelung oder -verdreifachung z.B. aus der Lasertechnik bekannt sind. Unter spezifischen molekularen Voraussetzungen im Objekt werden die eingestrahlten Photonen an geeigneten Stellen des Präparates kombiniert und liefern so zusätzliche strukturelle Informationen – ganz ohne künstliche Anfärbung des Objekts. Üblicherweise spricht man von einem SHG- bzw. THG-Kontrast (second harmonic generation und third harmonic generation).

Beleuchtungsformung
Ein kritischer Teil bei der Multiphotonenmikroskopie ist also die Beleuchtung. Das Ziel jeglicher Mikroskopie ist, vergrößerte Bilder des Präparates mit hoher Auflösung zu erzeugen. Die Vergrößerung wird nur benötigt, um das Aufgelöste unserem begrenzten Sehsinn sichtbar zu machen. Die hohe optische Auflösung dient dazu, neue Details des untersuchten Objektes darzustellen. Die optische Auflösung wird im Wesentlichen durch die Wellenlänge des Lichtes λ (die Farbe) und durch die Apertur NA des verwendeten Objektives bestimmt. Die theoretische Grenze ist erreicht, wenn das Mikroskop zwei separate Punkte im Objekt trennen kann, deren Abstand dA durch die Abbesche Formel [3] bestimmt ist: dA=λ/2NA. Dies gilt jedoch nur, wenn die Pupille des Objektivs homogen ausgeleuchtet wird.

Das Intensitätsprofil eines Laserstrahls ist nun aber nicht homogen, sondern zeigt im besten Fall eine Verteilung, die durch eine Gauß-Kurve beschrieben werden kann. Um dennoch höchste Auflösung zu erreichen, wird der Strahldurchmesser durch einen Strahlaufweiter vergrößert und die Pupille wird „überleuchtet“ (Bild 4, links). Dabei geht ein Teil der Laserenergie verloren. Da für nichtlineare Prozesse aber eine sehr hohe Intensität gewünscht ist, kann man auch umgekehrt den Strahl so steuern, dass möglichst viel Energie die Pupille durchstrahlt (Bild 4, rechts). Damit erhält man ein helleres Bild – jedoch auf Kosten der Auflösung [4]. Beides gleichzeitig ist nicht zu haben. Das Multiphotonenmikroskop SP8 DIVE von Leica kann nun gleichzeitig bis zu vier IR-Strahlen verwenden. Die Durchmesser dieser Strahlen können unabhängig voneinander mittels einfacher Regler in der Software eingestellt werden. Damit lässt sich die Bildqualität bezüglich Helligkeit und Auflösung zur gegebenen Situation im Präparat optimieren.

Bild 4: a) Strahlprofil, b) Verlauf im Mikroskop, mit P: Pupille, L: Objektiv, S: Präparat, c) Doppelkegel des Anregungslichts in Rot und Emission aus nichtlinearen Prozessen in Grün. Links für den Fall eines stark aufgeweiteten Strahls. Hier ist die Auflösung maximal (das grüne Volumen hat die kleinsten Abmessungen). Rechts für den Fall eines wenig aufgeweiteten Strahls, wobei das Volumen der Emission größer und die Emission heller wird. (Bild: Leica)

Ein weiterer Aspekt bei der Beleuchtung ist die Lage des Brennpunktes im Präparat. Diese Position ist abhängig von der Farbe. In der klassischen Mikroskopie werden diese Abweichungen durch geschicktes Design der Objektive für den sichtbaren Bereich des Spektrums weitestgehend behoben, wobei die Kosten deutlich mit der Güte der Korrektur ansteigen. Da in der modernen Mikroskopie in Biologie und Medizin üblicherweise mehrere Fluoreszenzmarker gleichzeitig verwendet werden, muss nun auch dafür Sorge getragen werden, dass alle Anregungen, die durch die IR-Beleuchtung ausgelöst werden, in der gleichen Ebene liegen.

Das Multiphotonenmikroskop SP8 DIVE von Leica kann bis zu vier IR-Beleuchtungen aufeinander korrigieren. Die Positionen der Anregung können unabhängig voneinander mittels einfacher Regler in der Software eingestellt werden, um alle IR-Anregungen in die gleiche Position zu bringen.

Bild 5: Korrektur des Farblängsfehlers für zwei IR-Wellenlängen. Links: Die dunkelrot dargestellte IR-Beleuchtung erzeugt eine Emission in Gelb in der Fokusebene fp. Eine in hellerem Rot angedeutete IR-Beleuchtung bei einer anderen Wellenlänge erzeugt eine Emission in Grün, die jedoch wegen der Längsaberration außerhalb der Fokusebene liegt. Rechts: Durch geschickte Wahl einer Divergenz der hellroten Beleuchtung wird das Volumen der Anregung, und damit der Emission, in die gleiche Position, nämlich in die Brennebene, gebracht. (Bild: Leica)

Emissionstrennung
Ein wesentlicher Aspekt in der Fluoreszenzmikroskopie ist heute die Korrelation unterschiedlicher Signale, etwa verschiedener Strukturelemente einer Zelle, die Expression unterschiedlicher Proteine bei der Entwicklung eines Organismus oder die Verteilung von Metaboliten oder Ionen in Abhängigkeit von vorangegangenen Reizen. Mit ausgefeilten Färbetechniken lassen sich solche Ziele in unterschiedlichen Farben auch in lebenden Organismen oder akuten Gewebeschnitten darstellen. Die einzelnen Emissionsfarben werden dann separaten Sensoren zugeführt, und Bilder werden in separaten Farbkanälen aufgezeichnet. Am Ende können diese Bilder wieder in verschiedenen Farben auf dem Monitor dargestellt werden.

In klassischen Fluoreszenzmikroskopen wird diese Auftrennung durch Farbteilerspiegel erreicht. Diese Spiegel sind in einer Weise beschichtet, dass z.B. blaues Licht reflektiert und rotes Licht durchgelassen wird. Die Wellenlänge, bei welcher der Übergang von Reflektion nach Transmission erfolgt, kann durch das Design der Beschichtung in weiten Bereichen kontinuierlich eingestellt werden. Der fertige Teilerspiegel ist jedoch nicht mehr variabel. Kaskadiert man mehrere solcher Elemente, lassen sich theoretisch beliebig viele Stücke aus dem Spektrum auf ebenso viele Sensoren richten, und die korrespondierenden Signale können simultan, ohne Zeitverlust, aufgezeichnet werden. In der Praxis wird eine Sequenz von fünf selten überschritten. Vor jedem Sensor wird nochmals ein Blockfilter eingeschaltet, mit dem man sicher stellen kann, dass nur das gewünschte spektrale Band aufgezeichnet wird, das ja schmaler sein kann, als das Intervall, das durch die Teilerspiegel ausgeschnitten wurde.

Bild 6: Multikanal-Bild einer “Konfetti-Maus”, aufgenommen mit dem 4Tune-Spektraldetektor des SP8 DIVE. Die hervorragende Anpassungsmöglichkeit der Emissionen an die transgenen Marker erlaubt viel höheren Kontrast bei mehrfarbigen Aufnahmen in tiefen Schichten lebenden Gewebes. (Präparat: J. van Rheenen, Utrecht Niederlande)

Um flexibel für allerlei Anwendungen mit unterschiedlichsten Fluoreszenzmarkern zu sein, werden in solchen Geräten an jeder Position für einen Teilerspiegel und für einen Blockfilter eine ganze Serie von Gläsern auf motorisierten Trägern vorgehalten. Man kann sich vorstellen, dass solch eine Anordnung komplex, teuer und justageanfällig ist – und dennoch nicht beliebig stufenlos variiert werden kann. Seit 1993 ist für konfokale Mikroskope das Problem der stufenlosen spektralen Auswahl durch eine einfache, aber intelligente Anordnung gelöst, dem SP-Detektor (Leica). Eine ausführliche Beschreibung zur spektralen Freiheit in allen Elementen eines konfokalen Mikroskops findet sich in [6].

Der SP-Detektor fußt auf der Tatsache, dass in einem konfokalen Mikroskop die Emission wieder über die Rasterspiegel zurückgeführt wird und der Strahl dann stationär ist, also keine Rasterbewegung mehr ausführt, und so durch ein Pinhole hindurchgefädelt werden kann. In der Multiphotonenmikroskopie braucht man jedoch kein Pinhole, und man kann die Emission direkt hinter dem Objektiv auskoppeln. Da hier der Strahl aber noch die Rasterbewegung ausführt, kann das Konzept des SP-Detektors nicht eingesetzt werden.

Bild 7: Im 4Tune-Detektor wird das Emissionslicht E durch variable Farbteiler VDS in kontinuierlich einstellbare Teilspektren aufgeteilt, die durch variable Bandfilter VBF geschärft werden können und dann simultan in mehreren Sensoren (1, 2, 3, 4) nachgewiesen werden. (Bild: Leica)

Ein naheliegender Vorschlag für die stufenlose Einstellung bei der Separation spektraler Bänder ist der Einsatz von Verlaufsfiltern und -teilerspiegeln. Solche Elemente sind so beschichtet, dass sich entlang einer Achse die Wellenlänge des Übergangs Reflexion-Transmission kontinuierlich ändert. Da nun aber der Strahl noch in Bewegung ist, würden sich auch die spektralen Eigenschaften des getrennten Lichts mit dem Rastervorgang verändern. Durch geschickte Ausnutzung der Winkelabhängigkeiten lassen sich diese Änderungen jedoch wieder kompensieren [7]. Eine verständliche Darstellung des Konzeptes findet sich in [8].

Fazit
Der 4Tune-Detektor von Leica Microsystems ist wesentlicher Bestandteil des SP8 DIVE Multiphotonenmikroskops. Durch Einsatz der oben erwähnten Verlaufsfarbteiler und Verlaufspaßfilter sind alle Elemente der Trennung des Emissionslichtes in bis zu vier Farbkanälen stufenlos einstellbar. Damit lassen sich für die verwendeten Farbstoffe beliebige spektrale Bänder einstellen; sowohl die Bildqualität (Signal-Rausch-Verhältnis) als auch die Güte der Trennung können so einfach und nachvollziehbar optimiert werden – und zwar direkt während der Aufnahme. Der zeitaufwändige manuelle Austausch von teuren Fluoreszenzfilterwürfeln ist damit obsolet geworden. Und als „Sahnehäubchen“ lässt sich das nichtlinear gestreute Licht aus SHG und THG ebenso bequem spektral nachführen, wenn man die Wellenlänge der Beleuchtung ändert.

AUTOR
Dr. Rolf T. Borlinghaus
Leica Microsystems, Mannheim

Literatur
[1] Göppert-Mayer M (1931) Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Göttinger Dissertationen. Annalen der Physik 401/3: 273–294.
[2] Sheppard CJR and Kompfner R (1978) Resonant scanning optical microscope. Applied Optics 17/18 pp 2879-2882.
[3] Abbe EK (1873) Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für Mikroskopische Anatomie 9(1):413–468.
[4] Helmchen F and Denk W: Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods 2/12 (2005) 932-940.
[5] Engelhardt J: Device for the selection and detection of at least two spectral regions in a beam of light. World Patent WO 1995007447 A1, priority Sep. 8th (1993).
[6] Borlinghaus RT: Konfokale Mikroskopie in Weiß. Springer Verlag Berlin-Heidelberg (2016) ISBN 978-3-662-49358-8.
[7] Gugel H, Neugart F and Böhm I: Scanning Microscope. World Patent WO 2016 / 198694 A1, priority June 11th (2015).
[8] Borlinghaus RT and Gugel H: Mission Impossible Accomplished: Tunable Colors for Non-descanning Detection. Leica ScienceLab 2017; (https://www.leica-microsystems.com/science-lab/mission-impossible-accomplished-tunable-colors-for-non-descanning-detection/).

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