HPLC-Tipp

Wie kann die Bodenzahl erhöht werden?

Der Fall:
In einem der nächsten HPLC-Tipps werden wir uns über folgenden Fakt unterhalten: Eine Erhöhung der Selektivität stellt mit Abstand die effektivste Maßnahme dar, um die Auflösung zu verbessern. Folglich sollte diesem Schritt als erstem die ganze Aufmerksamkeit zu Beginn einer Methodenoptimierung geschenkt werden. Wenn jedoch eine Verbesserung der Selektivität mit einem vertretbaren Aufwand nicht zu erzielen ist, wäre die Erhöhung der Bodenzahl der zweitbeste Weg. Welche Möglichkeiten gibt es nun, dies zu erreichen und welche Maßnahme „bringt“ wie viel?

Die Lösung
In Bild 1 sind die Möglichkeiten zusammengefasst, die zu einer Erhöhung der Bodenzahl führen.

Symbol-Erklärung:

N: Bodenzahl

R: Auflösung („Resolution“)

S/N: Peak/Rausch-Verhältnis („Signal to Noise“), Maß für die Nachweisgrenze

tR: Retentionszeit

„LM-Verbr.“: Lösungsmittelverbrauch

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L: Länge

dp: Partikeldurchmesser („Diameter Particel“)

T: Temperatur

ID: Innendurchmesser

„x“: „Erhöhung bzw. Erniedrigung um Faktor „x“
Kurze Kommentierung der Tabelle in Bild 1:
Zunächst folgendes vorweg: Eine Verringerung des Innendurchmessers führt zu einer Erniedrigung der relativen Massenempfindlichkeit – und des Lösungsmitteleverbrauchs –, der Innendurchmesser hat allerdings nichts mit der Auflösung zu tun. Da er jedoch immer wieder fälschlicherweise mit der Auflösung in Verbindung gebracht wird, habe ich auch den Innendurchmesser als Parameter in die Tabelle mit aufgenommen. Damit haben Sie ein „rundes“ Bild der Zusammenhänge.

Wie in einigen der jüngst erschienenen HPLC-Tipps demonstriert, gibt es eine Reihe von einfachen, kostenlosen oder quasi „kostenlosen“ Maßnahmen, die zu einer merklichen Verbesserung der Peakform führen können:

  • Einstellparameter: Beispielsweise Zeitkonstante, Datenaufnahmerate.
  • Optimierte“ Injektion: Evtl. Probenlösungsmittel bzw. pH-Wert der Probenlösung ändern, Probe verdünnen, Injektionsvolumen verringern.
  • Totvolumen der Apparatur: Kapillarinnendurchmesser und vor allem Zellvolumen verringern (Details siehe HPLC-Tipp im Mai).
    Erhöhung der Säulenlänge um Faktor 2 führt...
    ...zu einer Erhöhung der Bodenzahl um Faktor 2, das führt wiederum zu einer Verbesserung der Auflösung um Faktor 1,4 bei einer allerdings um Faktor 1,4 höheren Nachweisgrenze, einer doppelten Retentionszeit, einem doppelten Lösungsmittelverbrauch und einem doppelten Druck.
    Erniedrigung der Korngröße um Faktor 2 führt...
    ...zu einer Erhöhung der Bodenzahl um Faktor 2 und damit Verbesserung der Auflösung um Faktor 1,4 bei einer um Faktor 1,4 niedrigeren Nachweisgrenze, einem um Faktor 4 höheren Druck und konstantem Lösungsmittelverbrauch.
    Erhöhung der Säulenlänge um Faktor 2 und gleichzeitig Erniedrigung der Korngröße um Faktor 2 führen...
    ... zu einer Erhöhung der Bodenzahl um Faktor 4 und damit Verbesserung der Auflösung um Faktor 2 bei einer um Faktor 2 längeren Retentionszeit, einer konstant gebliebenen Nachweisgrenze, einem um Faktor 8 höheren Druck und einem um Faktor 2 höheren Lösungsmittelverbrauch.
    Erhöhung der Temperatur um Faktor 2:
    Bemerkung: Genaue Faktoren für die jeweilige Änderung sind schwer vorhersehbar, jene hängt u.a. stark vom Mechanismus ab. Halten wir dennoch wie folgt fest: Erhöhung der Bodenzahl (ob letzten Endes die Auflösung zu- oder abnimmt, hängt vom Mechanismus ab), Abnahme der Retentionszeit und des Lösungsmittelverbrauchs bei einer Abnahme des Druckes um Faktor 2.

    Bemerkungen:
    1. Das oben aufgeführte gilt für isokratische Trennungen, beim Gradienten sind die Verhältnisse etwas komplizierter [1].
    2. Die Praktikabilität einer Maßnahme sollte selbstverständlich ebenso stark im Fokus liegen – neben dem eigentlichen Ziel, der Verbesserung der Auflösung. So ist beispielsweise der Einsatz von (sehr) kleinen Teilchen nur in dafür ausgelegten Apparaturen möglich (Druck, Totvolumen!) – sofern man die Trennleistung der kleinen Teilchen möglichst ohne Verluste nutzen möchte. Oder aber, man optimiert die Apparatur selbst, das ist mit einem gewissen Aufwand schon möglich. Desweiteren bedarf es im Falle von „schwierigen“ Matrices unter Umständen einer aufwändige(re)n Probenvorbereitung.

    Das Fazit
    Es stehen uns eine Reihe von Möglichkeiten zur Erhöhung der Bodenzahl zur Verfügung. Es liegt auf der Hand, dass die einfachste – „richtige“ Einstellparameter vorausgesetzt – die optimale Injektion und die eleganteste die Verringerung der Korngröße darstellen. Das vorhandene Equipment und die Natur der Probe/Matrix entscheiden letzten Endes im Wesentlichen über die Praktikabilität und die Erfolgschancen einer Maßnahme. Ich hoffe, Bild 1 und die Kommentare dazu sind für Sie eine kleine Entscheidungshilfe, wenn es um Wege zu einer Erhöhung der Bodenzahl geht.

  1. H.-J. Kuss, S. Kromidas, unveröffentlichte Ergebnisse.

© by Stavros Kromidas

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