HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Sind hydrophobe oder polare Wechselwirkungen für meine Trennung notwendig? Der Fall
Bekanntlich können in der HPLC, je nach Analyt und chromatographische Bedingungen, hydrophobe Wechselwirkungen dominieren oder aber es liegt ein Mischmechanismus vor. Letzteres bedeutet in aller Regel, es sind zusätzliche polare oder gar ionische Wechselwirkungen wirksam – sterische Aspekte, die auch für kleine Moleküle eine Rolle spielen können, lassen wir hier außer Acht. Nun stellt sich erstens die Frage, wann herrschen vorwiegend eher hydrophobe bzw. eher polare Wechselwirkungen, und zweitens, welche sollte ich wann, wie begünstigen?

Die Lösung
Das hier angesprochene Thema ist ein sehr komplexes und es bedürfte eines nicht unbeträchtlichen Umfangs, wollte man jenes ein wenig genau behandeln. Dennoch sind aus neulich durchgeführten Messungen [1] einfache Regeln ableitbar, die abhängig von der Fragestellung eine gezielte Auswahl von Säule und Eluent erleichtern können. Nachfolgend werden in komprimierter Form einige Erfahrungen vorgestellt. Es zeigt sich abermals, dass das auf der makromolekularen Ebene in der Chemie bekannte Prinzip „Ähnliches mit Ähnlichem“ auch hier Anwendung findet.

Neutrale, apolare Moleküle gehen vorwiegend hydrophobe Wechselwirkungen mit RP-Phasen ein. Herrschen nun van der Waalsche Wechselwirkungen vor, verhalten sich auch sonst unterschiedliche RP-Phasen recht ähnlich. Was bedeutet das für die Praxis? Werden Analyte vorwiegend über ihren hydrophoben Charakter getrennt, ergibt sich nur ein geringer Selektivitätsunterschied auch unter unterschiedlichen Phasen. So bewegen sich beispielsweise die α-Werte von Toluol/Ethylbenzol (Differenz einer CH3-Gruppe, somit „klassische“ RP-Trennung) nur zwischen 1,45 beim hydrophoben Luna und 1,35 beim polaren LiChrospher Select B. Ein weiteres Beispiel sind Trennungen, bei denen saure/basische Moleküle mittels des pH-Wertes oder mit Hilfe von Ionenpaarreagenzien neutralisiert werden: In solchen gepufferten Systemen sind die Selektivitäten auch von unterschiedlichen RP-Phasen recht ähnlich, die Säulenauswahl ist sekundär, vereinfacht ausgedrückt: Den stationären Phasen wird in solchen Fällen die Chance „verwehrt“, ihre „Individualität (die im Wesentlichen durch die Differenz in ihrem polaren Charakter zum Tragen kommt) an den Tag zu legen. Liegen umgekehrt stark polare oder ionische Analyte vor oder geht es um die Trennung von Stellungsisomeren, verdrillten Strukturen usw., so gelingt die Trennung am besten, wenn polare Wechselwirkungen möglich sind. Wird – um auf das weiter oben angesprochene Beispiel zurückzukommen – statt Toluol/Ethylbenzol, Ethylbenzol/Fluorenon getrennt (Differenz in der Molekülgröße und in einer „O“-Gruppe), ergibt sich eine Bandbreite in den α-Werten von 1,0 bis 1,7. An polaren Phasen wird sogar Elutionsumkehr beobachtet: Sind polare Wechselwirkungen möglich, können die Phasen zeigen, was sie „können“. Polare/ionische Wechselwirkungen wären wie folgt zu verstärken:

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  • Statt Acetonitril Methanol als organisches Lösungsmittel verwenden.
  • Möglichst wasserarme Eluenten einsetzen.
  • Extreme Temperaturen, z. B. 15 und 60 °C, testen.

    Das Fazit
    Herrschen hydrophobe Wechselwirkungen – weil ich von vornherein neutrale Moleküle vorliegen habe oder aber ursprünglich ionisch vorliegende Moleküle via pH-Wert neutralisiert habe –, ist die Säulenauswahl bezüglich Selektivität sekundär, die Optimierung erfolgt eher über den Eluenten. Solche Trennungen sind in der Regel reproduzierbar, die Peaksymmetrie ist gut. Können Analyte erst durch (zusätzliche) polare/ionische Wechselwirkungen getrennt werden, lohnt sich schon eine größere Anzahl an RP-Säulen mit unterschiedlichem Charakter zu testen. Ionisierungsgleichgewichte (man sollte nicht nur an die Analyte, sondern auch an die polaren Gruppen an der Oberfläche der stationären Phase denken), und damit Retention und Peakform, können an erster Stelle mit Hilfe des pH-Wertes und an zweiter Stelle mit Hilfe des organischen Lösungsmittels sowie durch Temperatur-„Sprünge“ beeinflusst werden.

  1. Detaillierte Informationen finden sich in der Software „RP-Explorer 2007“, Infos unter http://www.novia.de.
    © By Stavros Kromidas
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