HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

RP-HPLC bei extremen pH-Werten


Der Fall
Nehmen wir an, die beste Selektivität erzielen Sie bei einem pH-Wert von ca. 1,5…2 bzw. 9…10. Ihre Säule ist in diesem Fall in der Regel nicht sonderlich begeistert: Im Saueren besteht die Gefahr der Abspaltung der funktionellen Gruppe(n) durch Hydrolyse („Bluten“ der Säule) – jene Gefahr ist um so größer, je kürzer/polarer die funktionelle(n) Gruppe(n) ist/sind. Im Alkalischen kann das Kieselgel sich auflösen. Was tun nun, um die Lebensdauer der Säule zu verlängern?

Die Lösung
Nachfolgend stichwortartig einige Empfehlungen für beide Fälle:
1. Arbeiten im Sauren:

Säule: Verwenden Sie möglichst Zorbax SB oder eine Hybrid-Säule (siehe weiter unten) oder einen „alten“ Klassiker wie LiChrospher oder Hypersil ODS – auf keinen Fall eine endcappte, moderne Phase. Denn: Je kürzer die Kette, um so eher kann sie abgespalten werden und die TMS- (Trimethylchlorsilan) oder die HMDS-Gruppe (Hexamethyldisylazan), die für das Endcapping verwendet werden, sind ja sehr kurze Ketten.

Eluent:

1. Möglichst Acetonitril als organisches Lösungsmittel verwenden – Methanol als relativ polares Lösungsmittel begünstigt Hydrolyse-Vorgänge.

2. In der Regel ist für den pH-Wert-Bereich von ca. 1,2…2,5 ausreichend, wenn der gewünschte pH-Wert mittels der entsprechenden Säure eingestellt wird (z. B. TFA, H3PO4, HClO4). Sollte tatsächlich ein Puffer vonnöten sein, gehen Sie möglichst nicht über eine Ionenstärke von ca. 20 mMol hinaus.

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Temperatur: Möglichst nicht über ca. 40…50 °C.

2. Arbeiten im Alkalischen:

Vorbemerkung 1: Wenn möglich, sollte vor dem Probengeber eine kurze Konditionierungssäule (z. B. eine C18-Vorsäule oder eine alte – aber saubere! – kurze Säule) eingebaut werden, um den Eluenten mit Kieselgel zu sättigen. Der Einbau soll im Falle von Gradientensystemen vor der Mischkammer erfolgen, denn sonst ändert sich das Verweilvolumen und damit die Retentionszeit.

Vorbemerkung 2: Wenn eher die Lebensdauer und nicht unbedingt die Effizienz im Vordergrund steht, sollten 2…3 µm Teilchen vermieden werden – jene werden im Alkalischen schneller aufgelöst als die etwas robustere 5 µm Teilchen.

Säule: Bis zu einem pH-Wert von ca. 8…9 „schaffen“ es die meisten modernen, endcappten, hydrophoben C18-Phasen wie Pursuit, Luna, Kromasil, Nucleosil HD, Hypersil BDS, YMC PRO RS usw. – je höher die Belegung (ab ca. 17…18 % C), um so stabiler sind die stationären Phasen im Alkalischen. Ab einem pH-Wert von ca. 10…11 wären an erster Stelle Hybridmaterialien (z. B. XBridge, Gemini, XTerra), an zweiter Stelle polymerisierte Materialien (z. B. Pathfinder, SMT OD, Gromsil CP, Nucleosil AB) und an dritter Stelle alternative Matrices zu Kieselgel wie Polymere, Zirkonoxid, Titandioxid, Hypercarb zu empfehlen. Denken Sie bitte bei letzteren an ihre Eigenarten: Druckempfindlichkeit, z. T. breite Peaks, „völlig“ andere Chemie der Oberfläche.
Eluent:

1. Acetonitril statt Methanol verwenden, siehe oben.

2. pH-Wert wenn möglich lediglich mit Triethyl-/Diethyl-/Dimethylamin oder Ammoniak einstellen – im Falle von Puffern möglichst organische Puffer wie TRIS, Borat, Glycin, Pyrrolidin verwenden, anorganische Puffer wie Carbonat und Phosphat vermeiden – ist dies nicht möglich, verwenden Sie als Kation lieber Lithium oder Natrium eher als Kalium oder gar Ammonium.

Bemerkung: Ich muss gestehen, dass ich letztens mehrere Tage mit NH4HCO3 an Hybridmaterialien bei einem pH-Wert von 10…11 gearbeitet habe, ohne irgendwelche Probleme festgestellt zu haben.
3. Pufferkapazität: Nicht höher als ca. 20 mMol.

Temperatur: Unter 40…50 °C bleiben.

Das Fazit

Arbeiten im Sauren dürfte das kleinere Problem darstellen: Nur teure, gut endcappte Phasen sind im Sauren recht ungeeignet. Bereits mit einem günstigen, „alten“ klassischen Material und einer Säure klappt es häufig. Bis zu einem pH-Wert von ca. 8…9 würde ich mir auch keinen Kopf großartig zerbrechen. Etwas teuerer (wegen der Säulenpreise) wird´s im richtigen Alkalischen. Apropos, was heißt hier „teuer“? Die Kosten der Analytik betragen ca. 5 % der Gesamt-Produktkosten, der Preis einer HPLC-Säule macht höchstens ca. 0,5…0,8 % aus…

© by Stavros Kromidas

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