Zellbeobachtung im Inkubator
Linsenlose Mikroskopie für die Überwachung von Zellkulturen
Die Charakterisierung des Zellwachstums, der Motilität und des Ansprechens auf Medikamente ist ein wichtiger Forschungsbereich in den Life Sciences; diese Prozesse sind jedoch normalerweise hinter den Türen von Zellkultur-Inkubatoren verborgen. Die linsenlose Mikroskopie ist ein Bioimaging-Verfahren, bei dem die optischen Eigenschaften der Zellen selbst ausgenutzt werden, um Licht zu modulieren und ein Bild zu erzeugen.
Damit ist eine kontinuierliche, nicht-invasive Überwachung von Zellkulturen in Inkubatoren möglich. Die linsenlose Mikroskopie, die auf einem besonderen Konzept für den Aufbau eines Mikroskops basiert, macht durch die Kombination biologischer und physikalischer Phänomene mit den Möglichkeiten des maschinellen Lernens eine automatisierte Analyse möglich.
Prinzip der linsenlosen Mikroskopie
Anstelle eines herkömmlichen Objektivs oder einer Linse wird bei der linsenlosen Mikroskopie das zelluläre Objekt selbst zur optischen Komponente. Wenn Licht durch die Probe fällt, wird es moduliert, und ein Sensor erfasst das daraus resultierende Muster. Verschiedene physikalische Effekte tragen zur Bildentstehung bei. Das aufgenommene linsenfreie Bild ist eine Kombination aus Fourier-Raum- und Realraumkomponenten [1].
Für die im Folgenden vorgestellten Anwendungen wurde das System Cellwatcher M von PHIO (s. Bild 4) eingesetzt. Es basiert auf der linsenlosen Mikroskopie und ist für die Überwachung von Zellkulturen und zellbasierten Assays während der gesamten Inkubation in biomedizinischen Forschungslabors konzipiert. Er hat sechs Sensoren, die so angeordnet sind, dass das Layout mit standardmäßigen 6-Well-Platten kompatibel ist, die üblicherweise für Zellkulturen und Assays verwendet werden, sowie eine halbkohärente LED-Lichtquelle, die rotes Licht mit einer Frequenz von 630 nm aussendet. Diese Frequenz gewährleistet unter anderem die Nicht-Invasivität der Methode. Das Mikroskopgehäuse ist ein Aluminiumrahmen mit der Grundfläche einer Standard-Wellplate (51 mm (Höhe) x 96 mm x 164 mm). Es wird über einen Minicomputer gesteuert und mit einem Cloud-Computing-Dienst für die automatisierte Analyse verbunden, ergänzt durch ein Kontrolldisplay, das magnetisch an der Außenseite des Inkubators angebracht wird und den aktuellen Zustand der Zellen oder die laufenden Experimente anzeigt.
Bei der Überwachung durch den Cellwatcher werden alle 30 Minuten Bilder aufgenommen. Zusammen mit der Software zur Verfolgung der Zelldynamik liefern diese wertvolle zeitlich-räumliche Informationen und detaillierte Einblicke in das Verhalten der Zellen in der Kultur im Zeitverlauf. Über eine KI-basierte Cloud-Plattform für die Bild- und Datenanalyse sowie Dokumentation haben die Forschenden auch außerhalb des Labors Zugang zu den Ergebnissen.
Die mangelnde Reproduzierbarkeit biologischer Studien ist ein viel diskutiertes Thema in der wissenschaftlichen Gemeinschaft. Eine Ursache für dieses Problem ist die nicht ausreichende Standardisierung der Zellexperimente. Die automatisierte Bestimmung des Konfluenzgrads einer Kultur beispielsweise verbessert die Reproduzierbarkeit, da sie für Konsistenz sorgt und die Subjektivität minimiert [2]. Die Analysesoftware verarbeitet Echtzeit-Bilddaten, um Diagramme zu erstellen, die verschiedene zelluläre Prozesse charakterisieren. Im Folgenden werden drei Anwendungen beschrieben.
Zellproliferation
Die Geschwindigkeit des Zellwachstums wird automatisch bestimmt, indem die Konfluenz der Kultur, ausgedrückt als Prozentsatz der zellbedeckten Fläche, über die Zeit verfolgt wird. Die Diagramme in Bild 2 zeigen die einzelnen Wachstumsphasen und Auswirkungen von Behandlungen auf die Wachstumsraten. Forschende konnten so beispielsweise nachweisen, dass eine Kombination aus microRNA und Chemotherapeutika das Wachstum von Brustkrebszellen erfolgreich beeinträchtigt [3].
Zellmotilität
Das kontinuierliche Überwachen ermöglicht außerdem, die Veränderungen von Bild zu Bild zu analysieren und dadurch Aufschluss über Richtung und Geschwindigkeit der Zellbewegungen zu erhalten. Die Motilität ist ein entscheidendes Merkmal bei zahlreichen zellulären Prozessen und ist besonders wichtig bei Studien zur Entwicklungsbiologie, Onkologie, Immunologie, Neurowissenschaft, Stammzellen, Kardiologie und Infektionskrankheiten. In einer kürzlich von Bortel et al. durchgeführten Studie wurde ein Cellwatcher bspw. zur Bewertung des Zellwachstums und der Zellmotilität einer Kolonkarzinom-Zelllinie vor und nach der Behandlung mit einem Krebswirkstoff eingesetzt [2]. Während sich das Zellwachstum zwischen Kontroll- und behandelten Zellen nicht signifikant unterschied, war die Motilität der behandelten Zellen stark reduziert, ein Effekt, der bei der Endpunktanalyse übersehen worden wäre.
Wundheilung
Sogenannte Wundheilungs- oder Scratch-Assays sind Standardverfahren, bei dem eine Schicht von Zellen bis zur Konfluenz kultiviert wird und eine "Wunde" durch Einritzen des Zellrasens mit einer Pipettenspitze erzeugt wird. Während die Zellen wieder in den Spalt hineinwachsen, wird die Breite dieser "Wunde" im Laufe der Zeit verfolgt. Sie dient so als Indikator für die Geschwindigkeit des Wundverschlusses. Traditionell muss bei diesem Verfahren die Kultur regelmäßig aus dem Inkubator geholt, Bilder aufgenommen und manuell analysiert werden, um die Breite der Wunde zu bestimmen. Hier wurde eine kontinuierliche automatische Bildaufnahme und -analyse mit dem System Cellwatcher durchgeführt. Eine detaillierte Analyse, wie teilweise in Bild 3 gezeigt, macht die Unterscheidung zwischen Proliferation und Migration möglich, ein Aspekt, der bei Scratch-Assays eine Quelle der Unsicherheit bei den Schlussfolgerungen von Studien darstellen kann.
Zusammenfassung
Die linsenlose Mikroskopie stellt eine bedeutende Innovation in der Zellmikroskopie dar. Sie nutzt die intrinsischen optischen Eigenschaften zellulärer Objekte und die Möglichkeiten von Machine-Learning-Algorithmen. Damit sind digital integrierte Lösungen für die kontinuierliche Überwachung von Zellkulturen möglich. Zu den Vorteilen gehören ein großes Sichtfeld, das eine umfassende Beobachtung zellulärer Prozesse ermöglicht, eine verbesserte Reproduzierbarkeit durch automatisierte Analyse und Dateneinblicke in Echtzeit. Die Methode hat auch Potenzial für künftige Anwendungen in 3D-Zellkultursystemen, um das Verständnis komplexer zellulärer Interaktionen auch in Gewebemodellen zu verbessern.
Literatur
[1] Rempfler, M. et al. (2018). Tracing cell lineages in videos of lens-free microscopy. Medical Image Analysis. https://doi.org/10.1016/ j.media.2018.05.009.
[2] Bortel, P. et al. (2024). Memory effects of prior subculture may impact the quality of multiomic perturbation profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences. http://www.pnas.org/doi/abs/10.1073/pnas.2313851121
[3] Köhler, B. et al. (2023). Unravelling the metastasis-preventing effect of miR-200c in vitro and in vivo. https://doi.org/10.1101/2023.11.14.566527.
AUTORIN
Dr. Anna Jötten
PHIO scientific GmbH, München
Tel.: 089/2023 6690
[email protected]
www.phio.de
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