Kühl-Bad Glacier G50

Kryokonservierung und Reanimation lebender Zellen

Scott Pratt*) und Dieter Rädler**)

Durch die Konservierung und Lagerung von Zellen haben Labore die Möglichkeit, Experimente durchzuführen, Immunisierungen zu entwickeln, Stammzellenforschung an menschlichen und tierischen Zellen zu betreiben sowie Pflanzenvarietäten und -hybride zu entwickeln. Bei frühen Laborversuchen auf dem Gebiet der Kryokonservierung wurde festgestellt, dass beim schnellen Einfrieren von Ova und Zygoten kleiner Labortiere mit Flüssigstickstoff Zellschäden auftreten. Aus weiteren Experimenten ging hervor, dass ein langsameres Einfrieren weniger Zellschäden zur Folge hatte.

Die Kryokonservierung wird seit Jahrzehnten für Pflanzenzellen, unbefruchtete (Oozyten)/befruchtete (Zygoten) menschliche und tierische Eizellen sowie für männliche Spermazellen verwendet. Beim Kryokonservierungsprozess wird typischerweise Flüssigstickstoff eingesetzt, um Zellen schnell bei -196 °C tiefzugefrieren. Dadurch werden alle Stoffwechselprozesse eingestellt, so dass die Zellen zur Lagerung, für den Transport oder zur späteren Verwendung konserviert werden. Nach dem Auftauen der Zellen werden die normalen Stoffwechselprozesse wieder aufgenommen.

Einzelne kleine Zellen können mit minimalen Zellschäden schnell eingefroren werden. Wenn allerdings größere und komplexere Zellen eingefroren werden, bilden sich Eiskristalle, die groß genug sind, um die Zellwände zum Reißen zu bringen. Es hat sich gezeigt, dass bei kontrollierten Gefriervorgängen mit Temperaturrampen zwischen Zimmertemperatur und -40 °C die Überlebensrate von Zellen deutlich steigt.

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Die veröffentlichten Ergebnisse der Europäischen Gesellschaft für humane Reproduktionsmedizin und Embryologie sowie Studien zur Kryokonservierung von Säugetierzygoten, die von medizinischen und biologischen Instituten durchgeführt wurden, machen deutlich, dass das Problem von Zellschädigungen aufgrund eines schnellen Gefriervorgangs gelöst werden muss, um die Kryokonservierung produktiv in der kommerziellen Industrie nutzen zu können. Klinische Tests des Instituts für Reproduktionsbiologie an der Tierärztlichen Hochschule Hannover zeigen, dass die Überlebenschancen der Zellen am größten sind, wenn sie langsam und programmiert eingefroren werden. Sperma und Oozyten von Mäusen wurden durch kontrolliertes Einfrieren bei -32 °C und anschließendes Tiefgefrieren mit Flüssigstickstoff auf die Lagerung vorbereitet. Die Zellen wurden dann durch Auftauen in einem Umwälzthermostat bei kontrollierten +20 °C revitalisiert. Die Viabilität von Sperma und Oozyten wurde anschließend hinsichtlich der Zellintegrität untersucht und zeigte eine Verbesserung von 7,5 % gegenüber dem schnellen Einfrieren.

Methodik des langsamen Einfrierens

Oozyten werden Mäusen 14 h nach der herbeigeführten Ovulation entnommen. Um die Zellen am Leben zu erhalten, werden sie in eine Hyaluronidase/phosphatgepufferte Salzlösung getaucht und in Petrischalen übertragen. Zur Vorbereitung der Zellen auf die Kryokonservierung wird nach und nach DMSO-Lösung hinzugefügt, so dass die Konzentrationen allmählich steigen. Am Ende werden 20...40 der Oozyten in kleine Kunststoffröhrchen gefüllt und die Enden mit Kunststoffstopfen versiegelt.

Mit dem Thermo Scientific Glacier G50 Tiefkühl-Umwälzthermostat werden die Röhrchen auf +15 °C vorgekühlt und 5 min auf dieser Temperatur gehalten. Anschließend wird die Temperatur allmählich reduziert, mit einem kontrollierten Temperaturabfall von 1 °C/min, bis -6 °C erreicht sind. Die Kristallisation wird bei -6 °C eingeleitet, indem das Röhrchen mit einer vorgekühlten Klemme berührt wird. Die Röhrchen werden weitere 5 min auf einer Temperatur von -6 °C gehalten und dann mit einem Temperaturabfall von 0,3 °C/min bis auf -32 °C abgekühlt. Sobald dieser Prozess abgeschlossen ist, werden die Proben in ein Lagerungssystem übertragen.

Auftauen

Zum Auftauen der Proben werden die Röhrchen aus dem Lagerbehälter entnommen und in das Glacier G50 Bad bei +20 °C gelegt, in dem sie in ca. 10 s auftauen. Die Frostschutzlösung wird dann langsam verdünnt, so dass die Konzentration geringer wird, und dann zweimal in Tyrode-Lösung gewaschen.

Befruchtung

Spermazellen, die mit demselben Verfahren wie die Oozyten zuvor eingefroren waren und aufgetaut wurden, werden mit einer Inkubationszeit von 2 h in eine Petrischale gegeben. Nach der Inkubationszeit werden die Zellen mehrmals in einer Lösung gewaschen, um das Zellwachstum vorzubereiten. Nach 24 h erreichen die Zellen die 2-Zellen-Phase und können der Empfängermaus eingesetzt werden. Die Reifezeit und Embryonalentwicklung nimmt 14 Tage in Anspruch.

Ergebnisse

Der Prozentsatz morphologisch intakter Oozyten nach dem kontrollierten Einfrieren und schnellen Auftauen war 7,5 % höher als bei vorherigen Methoden des schnellen Einfrierens und langsamen Auftauens. Die In-vitro-Fertilisation und die Embryonalentwicklung weisen dieselbe Erfolgsquote auf, unabhängig davon, ob Sperma und Oozyten frisch entnommen oder eingefroren und aufgetaut werden.

Schlussfolgerung

Die erfolgreichen Untersuchungen zur Kryokonservierung und Reanimation der Oozyten und Spermazoa von Mäusen haben eine kommerzielle Industrie hervorgebracht, die das kontrollierte Einfrieren und schnelle Auftauen von Zellen als Standardverfahren für die Kryokonservierung von Rinderembryos, bei der Erforschung von Pflanzen, der Erhaltung wertvoller Rassen und der menschlichen In-Vitro-Fertilisation nutzt.

Für den Labormitarbeiter ist entscheidend, dass seine Proben sicher sind und er optimale Ergebnisse erhält. Daher ist es wichtig, dass die die besten Kryokonservierungstechniken und -verfahren zum Einsatz kommen. Mit dem kompakten, leistungsstarken und mobilen Glacier G50 Bad können Anwender die Temperaturrampen steuern, die sie für ein sicheres Einfrieren und Auftauen der Proben benötigen. Racks, die speziell für die Röhrchen entworfen wurden, erleichtern die Handhabung. Durch den digitalen Kommunikations-Port lassen sich Experimente einfacher verfolgen.

*) Anwendungsspezialist, Thermo Fisher Scientific, Newington, NH, USA. **) Anwendungsspezialist, Thermo Fisher Scientific, Karlsruhe, E-Mail: dieter.raedler@thermofisher.com

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