Ready-to-use-Toxizitätstest

Tox-Assay aus dem Eis

Ein breiter Einsatz von Toxizitätsuntersuchungen an dreidimensionalen Gewebekulturen zur biologischen Sicherheitsbewertung wird durch die eingeschränkte Transport- und Lagerfähigkeit dieser Gewebekulturen beschränkt. Am Kryokompetenzzentrum für die Lebenswissenschaften arbeiten Ingenieure, Kryotechniker und Biologen seit 2015 an einer praktischen Lösung dieses Problems.

Seit mehr als 10 Jahren fordert und fördert die Europäische Union die Forschung an Alternativstrategien, um die Anzahl der Tierversuche für biologische Sicherheitstests an Industriechemikalien (im Rahmen der REACH-Verordnung), Pharmaka und Medizinprodukten drastisch zu verringern. Für Kosmetika besteht faktisch bereits seit 2013 ein europaweites Tierversuchsverbot. Die Forschung hat schnell reagiert und unter anderem eine Reihe neuer Prüfverfahren entwickelt, die Toxizitätsuntersuchungen in vitro an Gewebekulturen erlauben. Ein großes Problem besteht jedoch in der beschränkten Transport- und Lagerfähigkeit dreidimensionaler Gewebemodelle in Zellkulturplatten. In der bisherigen Praxis erfolgen Züchtung und Applikation von Gewebemodellen meist unter einem Dach, die Anwendung ist daher deutschlandweit auf wenige große Forschungsinstitute beschränkt, die z.T. exklusiv mit führenden Life-Science- und Kosmetikkonzernen verbunden sind. Ein breiter Einsatz der Technologie zur biologischen Sicherheitsbewertung wird dadurch verhindert, so dass In-vitro-Tests an Gewebemodellen trotz ihres enormen Potenzials bisher nur einen beschränkten Einfluss auf die Anzahl der „Tieropferungen“ haben.

Anzeige

Humanes Schleimhautmodell in der 48-Well-Zellkulturplatte
Am Kryokompetenzzentrum für die Lebenswissenschaften arbeiten Ingenieure, Kryo-techniker und Biologen seit 2015 an einer praktischen Lösung dieses Problems. Mit Förderung durch das Bundesministerium für Wirtschaft und Energie wird ein neuartiges Gewebemodell für Zytotoxizitätsuntersuchungen entwickelt, welches als weltweit erstes System mit gewebetypischer Komplexität kryokonservierbar ist. Es handelt sich dabei um ein humanes Schleimhautmodell in der 48-Well-Zellkulturplatte für den fluoreszenzphotometrischen Toxizitätstest an Lösungen und Extrakten. Im kryokonservierten Zustand kann es auf Trockeneis transportiert und bei -80 °C für mehrere Monate gelagert werden, was die Vermarktung über große Life-Science-Distributoren und einen bedarfsgerechten Einsatz in jedem Zellkulturlabor ermöglicht. Um wirtschaftlich konkurrenzfähig zu Tierversuchen zu sein, wurde der Assay im Hinblick auf eine hohe Kosteneffizienz konzipiert. So ist der Herstellungsprozess einfach und automatisierbar und kommt ohne zeit- und ressourcenaufwändige In-vitro-Kultur aus. Die Applikation fußt auf der „Ready to Use (RTU)“-Strategie und ist ein Novum für Gewebemodelle: Durchführung und Auswertung des Toxizitätstests erfolgen direkt in der Testplatte und erfordern weder einen Medientausch noch ein Umbetten der Konstrukte. Das macht die Anwendung einfach, robust und anwenderfreundlich.

Aufbau und Funktionsweise
Gemäß dem Ansatz einer einfachen und kosteneffizienten Herstellung erfolgt der Aufbau des Assays aus vorgefertigten Komponenten. Dieses Baukasten-Konzept soll perspektivisch auch als Basis für den Aufbau eines Portfolios an verschiedenen Testsystemen dienen. Als Trägersystem kommt eine Multiwell-Zellkulturplatte zum Einsatz. Das Wellplatten-Format ist weit verbreitet, gut standardisiert und ermöglicht eine automatisierte Testdurchführung und Auswertung. Die Gewebemodelle wer- den aus einer dreidimensionalen Kollagenmatrix und einem Zellträgergel hergestellt, welches in diese Matrix appliziert wird. Die Matrix dient als stabilisierendes Gerüst und Leitstruktur für die Gewebeintegration. Das Trägergel enthält suspendierte humane Primär- zellen in gewebetypischer Anzahl, so dass die- se nach kurzer Proliferationszeit durch die Ausbildung von Interzellularkontakten zur Gewebebildung befähigt sind. Wei- terhin sind alle für den Zellschutz wäh- rend der Kryokonservierung benötigten Gefrierschutzadditive und alle in der nachfolgenden Gewebekonsolidierungs- und Testphase benötigten Nährstoffe, Wachstumsfaktoren und Puffersubstanzen im Zellträgergel enthalten.

Bild 1: Strukturinduzierte, natürliche Gewebeformation auf einer mit Fibroblasten besiedelten Bi-Layer-Matrix (mittig) aus Kollagen unter dem Fluoreszenzmikroskop: Kompakte, mehrlagige Deckschicht auf der feinporigen Oberseite (links) und lockeres, dreidimensionales Bindegewebe in der großporigen Unterseite (Bilder: ILK Dresden).

Die Kryokonservierung erfolgt direkt nach der sterilen Assemblierung beider Gewebekomponenten in der Wellplatte. Nach dem Auftauen wird die verschlossene Testplatte für mehrere Tage bei 37 °C inkubiert, damit Matrix, Gel und Zellen eine Gewebestruktur bilden. Auf Pflegemaßnahmen wie Medientausch, Befeuchtung oder pH-Stabilisierung kann vollständig verzichtet werden. Auch die Testdurchführung gestaltet sich denkbar einfach: Bei Bedarf kann die Multiwellplatte mit den kryokonservierten Schleimhautmodellen im versiegelten Zustand bei 40 °C in einem Wasserbad aufgetaut werden. Anschließend wird eine mehrtägige Rekultivierungsphase benötigt, die es den im Trägergel suspendierten Zellen erlaubt, sich vom Stress der Kryokonservierung zu erholen und durch Ausbildung von Matrix- und Interzellularkontakten ein funktio-nales Gewebeäquivalent zu bilden. Die dafür benötigten Nährstoffe und Wachstumsfaktoren sind im Zellträgergel enthalten.

Zur Durchführung der Zytotoxizitätsprüfung werden die Prüflösungen mit einer Mehrkanalpipette auf die Gewebeäquivalente aufgegeben. Nach einer dreistündigen Einwirkzeit wird das Reagens hinzugefügt. Anschließend wird die Testplatte für weitere drei Stunden inkubiert und zur fluoreszenzphotometrischen Auswertung in ein Plattenlesegerät überführt. Der Arbeitsablauf ist mit Standardlabortechnik automatisierbar und erfordert keine Sterilität.

Bild 2: Wärmeüberträger-Einheit Multiwell-RACK (Prototyp) mit 48-Well Zellkulturplatte: Detail 1: Vibrationsmotor zur Synchronisation der Eisbildung; Detail 2: Iso-Belt zur Abschirmung der Wellplatte gegen konvektiven Wärmeaustrag.

Fertigung der Matrixkomponente
Als Basis für den Aufbau der Gewebepatches dient eine poröse, dreidimensionale Matrix, die für den gewünschten Gewebetyp und Einsatzzweck maßgeschneidert wird. Dazu wird das patentierte Gefriertrocknungsverfahren Model-based Ice Templating (MBIT) eingesetzt. Eine wässrige Kollagensuspension wird etwa 3 mm hoch in flache Schalen gefüllt und in einem zweistufigen Prozess zunächst eingefroren und anschließend gefriergetrocknet. Der Gefrierschritt wird im MBIT-Verfahren mit Hilfe eines statistischen Prozessmodells präzise geplant. Mit Hilfe einer Software lassen sich Suspensionschemie und Prozessparameter so einstellen, dass sich in der Suspension Eiskristalle einer gewünschten Form und Größe bilden. Während des Gefriervorgangs wird das suspendierte Kollagen an den Grenzflächen der Eiskristalle zur gewünschten, dreidimensionalen Materialstruktur verdichtet.

Die Eiskristalle dienen somit als Schablone (Template) für die Strukturprägung, wovon sich auch der Name des Verfahrens ableitet. Im nachfolgenden Gefriertrocknungsschritt wird das Eis entfernt. Die gefriergetrocknete Kollagenplatte wird im anschließenden Nachtrocknungsschritt thermisch stabilisiert. Zuletzt werden kreisrunde Scaffolds ausgestanzt und sterilisiert.

Gewebeaufbau und Assemblierung
Für den Aufbau eines zweilagigen Schleimhautmodells aus Bindegewebsschicht und Epithel wird eine Bi-Layer-Matrix mit zwei strukturell verschiedenen Materialschichten erzeugt. Dazu wird ein beidseitiger Gefrierprozess initiiert. Der Kollagensuspension wird von der Ober- und Unterseite gleichzeitig Wärme entzogen. So können von beiden Seiten nadelförmige Eiskristalle (Dendriten) senkrecht in das Innere der Suspension wachsen. Dort wird das Kollagen verdichtet und bildet eine zentrale, zelldichte Sperrschicht. Im oberen Bereich der zweigeteilten Matrix entsteht eine feinporige Deckschicht, während auf der Unterseite große, tunnelförmige Poren erzeugt werden. In beide Materialbereiche werden nun unterschiedliche Zellen desselben Spenders eingebracht. Die feinporige Oberseite der Matrix wird mit Keratinozyten besiedelt, die nicht in die kleinen Porenräume einwachsen und auf der Oberfläche der Matrix eine geschlossene Epithelschicht bilden. Die großporige Matrixunterseite wird mit Fibroblasten aufgefüllt, welche die tragende Bindegewebeschicht der Schleimhaut (Lamina propria) aufbauen (Bild 1).

Bild 3: Zeitlicher Verlauf der Kryokonservierung in der Multiwellplatte: Appliziertes Temperaturprogramm (blau) mit Vorkühlung auf -4 °C, Gegenkühlschritt zur Latentwärmekompensation und gewebespezifischer Abkühlrate von 2,3 K/min, synchronisierter Temperaturverlauf für 20 Gewebekonstrukte (grün-gelb).

Um einen vitalitätserhaltenden Gefrierprozess zu garantieren, werden die Zellen bereits in der Anzuchtphase vorkonditioniert und in einem Trägergel appliziert. Die Anzucht der Zellen erfolgt in Zellkulturflaschen. Vor der Ernte werden die reifen Zellen über das Kulturmedium mit kryoprotektiven Substanzen versorgt, die über Endozytose aufgenommen werden. Während hochdosierte Disaccharide die Bildung scharfkantiger Eiskristalle im Zytoplasma verhindern, bilden organische Stabilisatoren eine Schutzschicht um die inneren Membranen und Zellorganellen. Die Basis des Trägergels, welches alle benötigten Zellnährstoffe und Wachstumsfaktoren enthält, ist ein natürliches Mucopolysaccharid. Dieses reguliert durch sein Wasserbindungsvermögen die Eisbildung und bewahrt die Zellen im Gefrierprozess vor äußeren Schäden.

Die vorkonditionierten Zellen werden homogen im Trägergel suspendiert. Nach der Applikation des Keratinozyten-Gels auf die Oberfläche der Deckseite und des Fibroblasten-Gels in die großlumigen Porenräume der Matrixunterseite werden die so besiedelten Kollagenscheiben in die Kavitäten einer 48-Well-Zellkulturplatte eingebracht, welche für die Kryokonservierung mit einem Deckel verschlossen und steril versiegelt wird.

Kryokonservierung
Die Kryokonservierung der bestückten Assayplatte erfolgt in einem computergesteuerten Kammereinfriergerät mit Kaltgas-Zirkulation (Controlled Rate Freezer; s. Aufmacherbild). Das Vergasen flüssigen Stickstoffs im Gefrierraum garantiert hohe Kühlraten und ermöglicht eine applikationsspezifische Temperaturführung. Vorkühldauer und Gefrierrate der Gewebekonstrukte müssen exakt auf die zellspezifischen Bedürfnisse und die Arbeitsweise der Gefrierschutzadditive abgestimmt werden, um eine strukturschonende und vitalitätserhaltende Kryokonservierung zu ermöglichen. Deshalb wird über das Einfriergerät ein mehrstufiges Temperaturprogramm appliziert. Um dem Gewebe bereits vor dem Gefrierschritt möglichst viel Energie zu entziehen, wird die Assayplatte langsam von Raumtemperatur auf −4 °C vorgekühlt und so lange bei dieser Temperatur gehalten, bis alle Konstrukte eine identische Ausgangstemperatur erreicht haben. Die hochkonzentrierten Bestandteile des Trägergels sorgen dabei für eine deutliche Unterkühlung des Gewebes, so dass das enthaltene Wasser noch flüssig bleibt. Durch das Konzentrationsgefälle zur Gelmatrix wird den eingebetteten Zellen in der Vorkühlphase definiert Wasser entzogen. Dies schafft Raum für eine Volumenexpansion des Zytoplasmas beim Gefrieren und bewahrt die Zellmembran davor, beim Einfrieren zu bersten.

Im anschließenden Gefrierprozess müssen die Konstrukte mit einer konstanten, zellspezifischen Kühlrate von 2,3 K/min abgekühlt werden. Durch die Phasenumwandlung des im Gewebekonstrukt gebundenen Wassers erfolgt nun eine spontane Freisetzung der Phasenumwandlungsenergie in Form von Latentwärme. Durch rasches Gegenkühlen wird diese Latentwärme entzogen. Damit wird eine Verzögerung des Gefrierprozesses verhindert und eine Zerstörung des Gewebes durch das unkontrollierte Wachstum grobkristallinen Eises vermieden. Da der Wärmeaustrag durch den massiven Kunststoffboden der Wellplatte stark limitiert ist, erfolgt eine zusätzliche Moderation der Latentwärme durch die im Trägergel enthaltenen Kryoprotektiva.

Wärmetauscher-Equipment
Das Prinzip der Konvektionskühlung mit kaltem Stickstoffgas stellt ein großes Problem für die Einfrierung von Multiwellplatten in typischen Kammereinfriergeräten dar. Die freie Platzierung in der Gefrierkammer resultiert in einem ungleichmäßigen Wärmeaustrag. Im gasumströmten Randbereich der Platte wird die Wärme wesentlich schneller abgeführt als im Zentrum, so dass sich bereits in der Vorkühlphase extreme Temperaturdifferenzen zwischen innen- und außenliegenden Gewebekonstrukten ergeben. Eine identische und erfolgreiche Kryokonservierung ist nicht gewährleistet. Aus diesem Grund wurde eine Wärmeüberträger-Einheit entwickelt, welche die Wellplatte aufnimmt und den Temperaturausgleich zwischen Proben und Gefrierkammer vermittelt (Bild 2). Das sogenannte Multiwell-RACK arbeitet probenseitig als Kontaktkühler, der die Multiwellplatte nach außen gegen die Gasströmung abschirmt und intern einen raschen Temperaturausgleich ermöglicht. Die Wärme der Konstrukte wird gleichmäßig an einen Kupferwärmetauscher abgeleitet, der sie durch sein strömungsbrechendes Lamellendesign homogen an das zirkulierende Kühlgas überführt. So kann die Temperaturdifferenz innerhalb der Platte im Vergleich zur Einfrierung ohne die Wärmetauschereinheit um mehr als 95 % reduziert werden. Die Grundvoraussetzung für einen identischen Kryokonservierungserfolg aller Gewebekonstrukte ist damit erfüllt.

Die zweite Aufgabe des Multiwell-RACKs besteht in der Synchronisation des Gefrierbeginns. Um die Applikation einer konstanten, zellspezifischen Gefrierrate von 2,3 K/min auf allen Probenpositionen zu gewährleisten, ist ein gleichzeitiger Start des Gefrierprozesses bei einer homogenen Vorkühltemperatur von −4 °C unerlässlich. Als konzentrierte wässrige Lösung weist das Zellträgergel jedoch ein metastabiles Einfrierverhalten auf und neigt zu starker Unterkühlung. Spontan setzt der Kristallisationsprozess im Gewebekonstrukt daher erst bei Temperaturen zwischen −5 und −12 °C ein, wobei große Differenzen zwischen den verschiedenen Positionen der Multiwellplatte auftreten können. Die daraus resultierenden Abweichungen von der Zielkühlrate führen zu einer Schädigung der betroffenen Konstrukte. Um unerwünschte Unterkühlung zu vermeiden, wird die Eisbildung in allen Gewebekonstrukten zeitgleich ausgelöst. Dazu wird parallel zur Temperaturabsenkung über zwei im Multiwell-RACK integrierte Vibrationsmotoren eine zusätzliche Aktivierungsenergie aufgebracht. Die als Nukleationsauslöser benötigte spezifische Keimbildungsenergie von einem Watt pro Milliliter Probenvolumen wird als Schwingungsenergie in die Konstrukte eingetragen. Innerhalb von 30 s setzt auf allen Positionen der Multiwellplatte spontane Eisbildung ein und der Gefrierprozess aller 48 Gewebekonstrukte verläuft mit einer Kühlrate von 2,3±0,2 K/min nahezu synchron (Bild 3). Bei einer Probentemperatur von −35 °C ist der Gefrierprozess abgeschlossen. Das Assay kann nun mit beliebiger Kühlrate auf eine Lagertemperatur von −85 °C abgekühlt, aus dem Multiwell-RACK entnommen und in eine Laborgefriertruhe überführt werden. Unterhalb von −80 °C ist es dort für viele Monate lagerfähig.

Autoren
Holger Reinsch, René Kretschmer, Dr. Gabriele Spoerl

Center of Cryo Competence in Life Sciences − Institut für Luft- und Kältetechnik gemeinnützige Gesellschaft mbH, Dresden
Kontakt: Holger.reinsch@ilkdresden.de

Anzeige

Das könnte Sie auch interessieren

Anzeige
Anzeige

Effizienz und Leistung

Die neue Pioneer mit vielen Funktionen zum intelligenten Betrieb in Ihrem Labor. Mit antistatischem Stab zur Erdung. Weitere Informationen über die Waagen Pioneer PX

 

mehr...
Anzeige

Newsletter bestellen

Immer auf dem Laufenden mit dem LABO Newsletter

Aktuelle Unternehmensnachrichten, Produktnews und Innovationen kostenfrei in Ihrer Mailbox.

AGB und Datenschutz gelesen und bestätigt.
Zur Startseite