Bioanalytik

Partikelgrößenbestimmung von Biopharmazeutika

Die Biotechnologie gewinnt bei der Produktion von Medikamenten immer mehr an Bedeutung. Ziel ist es, Proteine herzustellen, die direkt in die Stoffwechsel-Vorgänge des Organismus eingreifen. Dabei handelt es sich nicht um „kleine“ Wirkstoffmoleküle, sondern um komplexe Proteinmoleküle.

Biopharmazeutika

Zur Produktion solcher Biopharmazeutika werden zumeist lebende Organismen bzw. tierische oder pflanzliche Zellen eingesetzt, die in sogenannten Bioreaktoren die Proteine erzeugen.

Proteine neigen dazu, Aggregate zu bilden. Mehrere Proteine haften dabei aneinander und bilden Agglomerate. Mit der Bildung großer Proteinverbünde sinkt die Wirksamkeit der Biopharmazeutika. Für viele Hersteller von Biopharmazeutika ist die Bestimmung der Partikelgröße daher ein wesentliches Instrument zur Beurteilung der Produktqualität [1].

Die Größen von Proteinen sind sehr unterschiedlich; sie können im Bereich von zehntel Nanometern bis hin zu mehreren hundert Nanometer groß sein. Die entstehenden Aggregate können Verbünde aus bis zu mehreren tausend Proteinen oder mehr sein [2].

Bild 1: Messprinzip der statischen Laserbeugung.

Statische Laserbeugung zur Partikelmessung
Um die Größenverteilung solcher Partikel zu messen, gibt es verschiedene etablierte Verfahren. Die statische Laserbeugung ist eine der verbreitetsten Methoden. Bei diesem Verfahren passiert ein Laserstrahl eine Partikelsuspension. Dabei wird das Licht des Lasers gebeugt und gestreut (Bild 1). Die dabei entstehenden Beugungsmuster sind charakteristisch für die Größe der Partikel. Der deutsche Physiker Gustav Mie hat hierzu die grundlegenden Berechnungen der Streuung von elektromagnetischen Wellen an einer Kugel vorgenommen. Aufgrund seiner mathematischen Lösung wird aus der Lichtverteilung eines Beugungsmusters eine Partikelgrößenverteilung berechnet [3].

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Bild 2: Wing-Detektor mit 78 einzelnen Detektorelementen zur Erfassung des Beugungsmusters.

Shimadzu stellt nun mit seinem „Aggregate Sizer“ ein Analysensystem vor, das speziell für die Partikelgrößenanalyse von Proteinen entwickelt wurde. Es arbeitet mit der statischen Laserbeugung und hat einen Messbereich von 7 nm bis 800 µm. 78 einzelne Detektorelemente erfassen die Lichtverteilung des erzeugten Beugungsmuster (vgl. Bilder 1 + 2).

Fourier-Optik: bessere und schärfere Auflösung
Der optische Aufbau entspricht der sogenannten Fourier-Optik [3]. Hierbei wird die Probe im parallelen Lichtstrahl gemessen, bevor eine weitere Linse das Licht der Beugungsmuster fokussiert. Der Vorteil dieser Optik liegt in einer wesentlich besseren und schärferen Auflösung als bei der ebenso verwendeten Reverse-Fourier-Optik. Bei diesem optischen Aufbau wird die Probe im konvergenten Lichtstrahl gemessen. Die Fourier-Optik ermöglicht zudem den Einsatz von Zellen größerer Schichtdicke als bei der Reverse-Fourier-Optik.

Bild 3: Lichtverteilung der Albumin-Suspension auf den Detektorelementen.

Um die Proteinsuspension zu messen, stehen zwei verschiedene Messzellen zur Verfügung. Bei der sogenannten Batch-Cell handelt es sich um eine Küvette mit einem Füllvolumen von etwa 5 ml. Eine integrierte Rührplatte hält die Suspension homogen.

Messzelle auch für kleine Probenmengen
Die Proteine sind aufgrund der aufwendigen Herstellungsverfahren entsprechend kostbar. Die Probenvolumina sollten daher möglichst klein gehalten werden. Dazu steht eine weitere Messzelle zur Verfügung. Hier genügen Probenmengen von etwa 0,4 ml, um die Proteine zu vermessen.

Für Testmessungen wurde eine Albumin-Suspension herangezogen. Das eigentliche Messsignal ist die Lichtverteilung auf den Detektorelementen (Bild 3). Die grünen Balken entsprechen dem Lichteinfall auf dem jeweiligen Detektorelement, das durch Beugung und Streuung auf den Detektor gelangt. Aus dieser Lichtverteilung wird schließlich die Partikelgrößenverteilung berechnet (Bild 4). Man erkennt, dass die Albumin-Proteine Aggregate in verschiedenen Größenbereichen gebildet haben. Die kleineren Aggregate liegen in einem Größenbereich von 110...340 nm, die größeren Aggregate im Bereich von 650...1400 nm.

Bild 4: Albumin-Protein-Aggregate in verschiedenen Größenbereichen.

Neue Software: schnelles Auslesen, kontinuierliche Messung
Der einfache Messaufbau des Aggregate-Sizer mit nur einem Laser ermöglicht ein sehr schnelles Auslesen der Detektorsignale. Ohne Umschalten zwischen den einzelnen Detektoren oder unterschiedlicher Laser werden die Beugungsmuster quasi online erfasst (alle 0,145 s). Dadurch lassen sich sehr schnelle Messungen von einer Sekunde realisieren.

Zudem ermöglicht die Software eine kontinuierliche Messung der Probe. Das bedeutet, dass die Software in vorgegebenen Zeitintervallen automatisch die Partikelgrößenverteilung erfasst und speichert. Das kleinste Intervall ist ebenfalls 1 s. Insgesamt kann die Wing-Sald-Software 200 Partikelgrößenverteilungen automatisch nacheinander aufnehmen und speichern. Auf diese Weise lässt sich beispielsweise das Agglomerationsverhalten von Partikeln beobachten und sichtbar machen.

Eine Besonderheit ist die zusätzliche Möglichkeit, neben der Partikelgrößenverteilung die enthaltene Menge der Proteine zu bestimmen. Im Partikelgrößenbereich von 100 nm bis hin zu 10 µm wird die Konzentration (µg/ml) der Proteine in der Suspension bestimmt.

Bild 5: Partikelgrößen in einer Modell-Suspension (Partikel mit 200 nm, 1 μm und 3 μm).

Ein weiterer Versuch (Bild 5) zeigt die Messung unterschiedlicher Partikelgrößen in einer Suspension. Dazu wurden verschiedene Polystyrol-Standards mit Größenbereichen von 200-nm-, 1-µm- und 3-µm-Partikeln vermengt und gemessen. Die Messung zeigt genau diese drei Maxima. Aufgrund des verwendeten optischen Aufbaus sind die Größenverteilungen des Aggregate-Sizer sehr scharf. Es kommt hier zu keiner Überlappung von Peaks und so können auch Proben, die unterschiedlichste Partikelgrößen enthalten, eindeutig bestimmt werden.

Fazit
Der Aggregate-Sizer ist ein System, speziell entwickelt, um die Partikelgrößenverteilung von Proteinen schnell und sicher zu bestimmen. Die kleinen Zellen ermöglichen den Einsatz kleinster Volumina, und der optische Aufbau und der große Detektor erlauben sehr schnelle Messungen von einer Sekunde in höchster Auflösung. Dies ist vor allem interessant, um das Agglomerationsverhalten der Proteine zu beobachten.

Literatur
[1] Biotechnology, Quantitative Laser Diffraction Method for the Assessment of Protein Subvisible Particles.
[2] Broschüre Aggregate Sizer – Aggregation Analysis System for Biopharmaceuticals.
[3] 13320:2009(E) Particle size analysis — Laser diffraction methods.

Sascha Hupach, Produktspezialist, Shimadzu Deutschland GmbH

Autor:
Sascha Hupach
Produktspezialist
Shimadzu Deutschland GmbH
E-Mail: info@shimadzu.de

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