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Next Generation Microarrays

Was Sie schon immer über das Proteom wissen wollten…

Markierungsfreie Hochdurchsatz Protein-Protein Interaktionen mit Next Generation Microarrays. Die Proteomics gelten als eine der biotechnologischen Schlüsseldisziplinen des 21. Jahrhunderts. Zu Recht werden sie verstanden als der konsequente Schritt, der der Genomik zu folgen hat.

SCORE: Single Color Optical Reflectometry. Interferenzreflektometrisches Verfahren zur markierungsfreien Detektion von molekularen Bindungen. Das next generation microarray Format ermöglicht die Aufnahme von kompletten Bindungskurven von mehreren 10.000 Interaktionen parallel und in Echtzeit.

Das ist umso verständlicher, führt man sich vor Augen, dass die Genomik zunächst nur einen Bauplan darstellt, während die Proteomics funktionale Moleküle und deren Interaktionen untersucht. Diese Gegenüberstellung zeigt eine grundlegende Herausforderung der Proteomic an sich: während diese neue Disziplin nicht weniger verspricht als die Kartierung der Funktion des Lebens, sind die Kombinationsmöglichkeiten und Einflussfaktoren so vielfältig, dass sie mit derzeitigen Methoden nicht oder zumindest nicht vollumfänglich zugänglich sind. Einen wichtigen Beitrag zu diesen Fragestellungen liefern neue Entwicklungen im Bereich der Massenspektrometrie. Während hier Proteine und Proteinbruchstücke hinsichtlich ihrer Identität aufgeklärt werden können und somit umfangreiche molekulare Bibliotheken vervollständigt werden, bleiben funktionale Screenings derzeit noch in der Minderheit. Allerdings sind es gerade die funktionalen Aspekte der Proteine, also deren Wechselwirkungen untereinander und mit Co-Faktoren wie Antikörpern, Enzymen oder Hormonen, die intra- und interzelluläre Abläufe und Kommunikationsprozesse steuern und initiieren.

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Zu deren Verständnis ist die Analyse von Protein-Protein-Interaktionen als ein Teilgebiet der Proteomics ein wesentlicher Ansatz. Um der großen Menge an Substanzen gerecht zu werden, sind Screening-fähige Ansätze erforderlich, die eine Batch-Verarbeitung von großen Substanzbibliotheken erlauben. Der Microarray-Ansatz, der im Bereich der Genomik etabliert wurde, bietet diese Möglichkeit, indem er mehrere Tausend Interaktionen auf einem speziell beschichteten Mikroskop-Objektträger nachweisen kann. Allerdings beinhaltet diese fluoreszenz- oder lumineszenzbasierte Technologie einige Einschränkungen, die ihre Anwendbarkeit in der Proteomic limitiert. Zum einen besteht durch Interferenz der Farbstoffmarkierung mit dem Microarray grundsätzlich die Gefahr der Messung von Artefakten, sei es durch unspezifische Bindung des Labels an die Oberfläche oder durch Verlust von schwachen Bindern während der erforderlichen Waschschritte.

Eine viel größere Limitation besteht jedoch in der Beschränkung auf Ja- oder Nein- Aussagen als Identifikation eines Bindungsereignisses oder auf Konzentrationsbestimmungen zur Beschreibung der Effektivität der Bindung. Während dieser Informationsgehalt im Falle der Genomics vollkommen ausreichend ist, werden in den Proteomics umfangreichere Informationen über das jeweilige Bindungsereignis benötigt. Ein Grund hierfür ist, dass Proteine in Bindungskaskaden eingebunden sind und dort unter anderem die Bindungskinetiken beeinflussen, wie und ob eine Signaltransduktion abläuft. Daher sind insbesondere kinetische Daten wie die Assoziations- und die Dissoziationsratenkonstanten und die daraus abgeleitete Affinitätskonstante wichtige Größen, um Protein-Interaktionen zu charakterisieren. Man kann sich die Interaktionen innerhalb einer Zelle vorstellen wie einen Konkurrenzkampf zwischen einer Vielzahl von Partnern. Einige davon können gar nicht miteinander in Wechselwirkung treten, bei anderen ist die Beziehung komplizierter, sie können hervorragend, wenig gut oder mehr schlecht als recht miteinander – also ganz so, wie in der makroskopischen Welt. Um zu verstehen, welcher Interaktionsweg, an dem häufig sogar eine Vielzahl von Partnern beteiligt ist, der wahrscheinlichste ist, muss die Qualität der Bindung bewertet werden, zum Beispiel über ihre Affinitätskonstante.

Ausschnitt einer SCORE-Messung von 300 Varianten des FLAG-Epitopes gegen einen Anti-FLAG Antikörper. Das Diagramm zeigt exemplarisch 6 Bindungskurven, die von Interaktionen im gekennzeichneten Bereich stammen.

Seit den 1990er Jahren werden Verfahren eingesetzt, die diese kinetischen Daten mit hoher Präzision bestimmen können. Die Herausforderung hierbei ist, dass diese Bestimmung ohne eine zusätzliche Markierung mit Farbstoffen erfolgen muss, um verlässliche kinetische Daten zu erhalten. Ausgehend von den frühen Arbeiten mit Oberflächenplasmonenresonanzen (surface plasmon resonance, SPR) haben sich eine Reihe von Technologien entwickelt, die molekulare Interaktionen markierungsfrei detektieren und quantifizieren können. Das funktioniert so gut, dass die U.S. Food and Drug Administration (FDA) diese Untersuchungen obligatorisch für die Marktzulassung neuer Pharmazeutika vorschreibt. Unbeschadet der herausragenden Qualität dieser markierungsfreien Methoden eignen sie sich dennoch nur bedingt für die Anwendung in der Proteomic, da sie nur wenige Interaktionen simultan pro Lauf erfassen können und somit den extremen Anforderungen an Durchsatz, den die Proteomics fordern, nicht gerecht werden können.

Berthold Technologies bietet mit der Next Generation Microarray SCORE-Technologie ihres Partners Biametrics die Antwort auf diese Einschränkung: das bScreen LB 991 System kombiniert die Flexibilität und den Durchsatz von Microarrays mit dem Informationsgehalt von markierungsfreien Methoden. Mit der SCORE Technologie ist es zum ersten Mal möglich, eine komplette Protein-Bibliothek als Microarray zu drucken und die komplette Bindungskinetik für jede einzelne Bindung mit hoher Präzision aufzuzeichnen. Das System arbeitet nach dem Prinzip der kamerabasierten optischen Interferenzreflektometrie und ist daher nicht an ein vorgegebenes Muster der Proteinimmobilisierungen gebunden. Die verwendeten Biochips haben das Standard-Objektträgerformat und sind daher vollständig kompatibel zu gängiger Microarray-Infrastruktur, so dass existierende Genomik-Einrichtungen unproblematisch für Proteomic-Anwendungen umgerüstet werden können. Das Potential der SCORE-Technologie zeigt das folgende Beispiel des Epitope-Mapping. 300 Variationen des FLAG-Epitopes wurden als Array auf einen Biochip gedruckt und die Bindung des FLAG-Antikörpers, der kontinuierlich über das Array gepumpt wurde, wurde in Echtzeit verfolgt (Bild 1), wobei zu jeder einzelnen Epitope-Antikörper Bindung parallelisiert eine vollständige Bindungskurve aufgezeichnet wurde. Zwischen den einzelnen Epitopen sind deutliche Unterschiede hinsichtlich ihrer Bindungsstärke und ihrer Bindungskinetik erkennbar. Zusammen erlauben es diese Daten, das jeweilige Epitop hinsichtlich seiner Bindungseigenschaften vollständig zu charakterisieren. Protein-Protein-Wechselwirkungspaare können somit in ein Ranking überführt werden, das als Basis für die Vorhersage von komplexen Interaktionskaskaden dienen kann. Da die SCORE-Technologie als markierungsfreies Verfahren auf Waschschritte verzichtet, können auch sukzessive Bindungen, bei denen eine Vielzahl von Proteinen nacheinander miteinander interagieren, vermessen werden. Hier kommt wiederum der Vorteil des hohen Durchsatzes des Microarray-Prinzips zum Vorteil, da die Bindungspartner parallelisiert durch unterschiedliche Immobilisierungsmuster durchpermutiert werden und unter identischen Messbedingungen analysiert werden können.

Fluoreszenzauslesung der Probe aus Bild 1. Die größere Anzahl der detektierten Bindungsereignisse ist auf unspezifische Wechselwirkung der Fluoreszenzmarkierung zurückzuführen (Falsch-Positive)

Durch die volle Kompatibilität zu etablierter Microarray-Infrastruktur lassen sich die mit dem bScreen untersuchten Proben im Anschluss anfärben und als konventionelles Fluoreszenz- oder Lumineszenzmicroarray auslesen. Bild 2 zeigt das Fluoreszenzbild der oben diskutierten FLAG-Anti-FLAG-Messung, bei dem in Teilen Abweichungen zum SCORE-Bild zu erkennen sind. Diese Abweichungen stammen von unspezifischen Wechselwirkungen des Fluoreszenzlabels mit dem FLAG-Epitope („Falsch-Positive“) und repräsentieren keine spezifische Bindung zwischen dem FLAG-Epitop und dem Anti-FLAG Antikörper. Die SCORE Technologie liefert daher nicht nur zusätzliche kinetische Information, sondern bietet auch eine gegenüber vielen etablierten Hochdurchsatzverfahren verbesserte Datenqualität, da die Messung nicht durch Markierungssubstanzen beeinflusst wird.

Next Generation Microarrays und die Biametrics SCORE Technologie bieten für einen umfassenden Einblick in funktionale Aspekte der Proteomics. Herkömmliche Grenzen hinsichtlich Durchsatz, Informationsgehalt oder Parallelisierung werden durch das neue Verfahren, das erstmal im bScreen LB 991 Label-free Microarray System zum Einsatz kommt, aufgehoben, so dass Sie endlich selber messen können, was Sie schon immer über das Proteom wissen wollten…

Dr. Frank Schleifenbaum

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