HPLC-Tipp

Benutze deine UHPLC in diesen Fällen lieber nicht als UHPLC...

Der Fall
Die LC-Anlage von heute ist eine UHPLC. Die UHPLC hat zweifelsohne Vorteile; so sind beispielsweise Anwender zufrieden ob der kurzen Läufe, der "guten" Trennungen und des geringen Lösemittelverbrauchs. Möchte man nun seine UHPLC wirklich unter UHPLC-Bedingungen betreiben (z.B. 50 mm, 2,1 mm, ≤2 μm, Druck ≥700...800 bar) so gibt es Fälle, in denen man es lieber nicht tun sollte. Tut man es doch, so sind Probleme zwangsläufig vorprogrammiert. Welche Fälle wären das?

Die Lösung
Es gibt eine Reihe von Situationen, in denen Trennungen unter HPLC-Bedingungen sinnvoller als unter UHPLC-Bedingungen sind [1]. Ich greife willkürlich vier Fälle auf, die nachfolgend skizziert werden.

  • Schwierige Matrix:
    Im Falle einer schwierigen Matrix wie Gewebe, Pflanzenextrakt, Mülldeponieprobe, Fermenterbrühe, Lebensmittel, Tierfutter, etc. muss jene durch die  Probenvorbereitung besonders gründlich entfernt werden. Ist dies gar nicht  möglich, so zeigt sich, dass Säulen mit ≤2-μm-Teilchen häufig(er) verstopfen.
  • Stärkeres Probenlösemittel als der Eluent/Anfangsgradient:
    Manchmal ist es so, dass die interessierende(n) Komponente(n) nur mit Acetonitril, Alkoholen oder Tetrahydrofuran aufzulösen bzw. zu extrahieren ist/sind. Somit ist die Probenlösung stärker (sprich: organischer) als der Eluent/Anfangsgradient. In diesem Fall haben wir mit Fronting zu kämpfen, im Worst Case entstehen sogar Doppelpeaks. Aufgrund der kleinen Säulenvolumina in der UHPLC (z.B. für eine 5 x 2,1-mm-Säule ca. 200 μl [2]) bleibt die schlechte Peakform bestehen. Die "gute" Bodenzahl durch die ≤2-μm-Teilchen - "gut" ist bei diesen kurzen Säulen so eine Sache... - kann das Fronting nicht egalisieren. Bei konventionellen Säulen (länger/dicker und somit größeres Säulenvolumen) besteht das Problem in der Regel nur bei den früh eluierenden Peaks und bei Injektionsvolumina ab ca. 15...20 μl.
  • Niedrige Nachweisempfindlichkeit gewünscht:
    Eine Faustregel besagt, das Injektionsvolumen sollte 1 % des Säulenvolumens nicht überschreiten, das wäre bei einer 50 x 2,1-mm-Säule 1...2 μl. Wird diese Regel nicht eingehalten, so macht sich eine Volumenüberladung - vor allem bei früh eluierenden Peaks - bemerkbar. So weit so gut. Eine große Detektorzelle nun kann in der UHPLC nicht verwendet werden, weil durch das größere Dispersionsvolumen (Totvolumen) der Peak breiter werden würde. Eine solche wäre allerdings laut Lambert-Beer-Gesetz wegen des dann längeren Lichtwegs und des sich dann größer ergebenden Signals notwendig. Im Falle einer konventionellen Säule ist beides möglich: Mehr injizieren plus große (genauer: lange) Detektorzelle verwenden. Merke somit: Die Nachweisempfindlichkeit ist in der HPLC immer besser als in der UHPLC. Wenn ich allerdings nicht mehr injizieren kann/darf, dann kann die UHPLC ihre Stärke ausspielen (hier: bei großen Drücken arbeiten zu können): Dünne Säule plus 1,3-...2-μm-Teilchen verwenden. Die Massenempfindlichkeit ist in der UHPLC immer besser als in der HPLC.
  • Wechselnde chromatographische Bedingungen in Kombination mit unerfahrenen Anwendern:
    Im Falle von gleichbleibenden chromatographischen Bedingungen, einem relativ einfachen Trennproblem und "sauberen" Proben ist UHPLC sicherlich eine feine Sache: Schnelle Trennungen, genügend gute Auflösung, geringer Lösemittelverbrauch. Sind stets variierende Bedingungen im Spiel, können nur erfahrene Anwender - und ohne Zeitdruck - UHPLC in der Routine(!) erfolgreich betreiben. Bemerkung: Wenn ich in diesem Zusammenhang von "UHPLC" spreche, dann meine ich wirklich UHPLC und nicht lediglich schnelle HPLC bei 600 bar und 10...15 min Laufzeit. Merke: Falsch geschnittene Kapillaren, keine genügend saubere und gegebenenfalls zusätzlich filtrierte mobile Phase und Chemikalien, keine perfekt sitzenden Fittings, keine UHPLC-gerechte Einstellungen an der Software, usw. "verzeiht" die UHPLC nicht - die HPLC schon.
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Das Fazit
Alles hat Vor- und Nachteile, die UHPLC stellt hier keine Ausnahme dar. So definiere zuerst genau, was du hast und was du willst, und kläre erst dann, ob die UHPLC dir das liefern kann, was du brauchst.

[1] Stavros Kromidas, Vortrag "Wann sollte ich meine UHPLC als UHPLC betreiben", NOVIA-HPLC-Tage, November 2014.
[2] Steffan Lamotte, BASF Ludwigshafen, persönliche Mitteilung.

Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken
www.kromidas.de

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