HPLC-Tipp

Das Totvolumen: Wie kritisch ist es wirklich? Und: Ist ein solches „schlimmer“ vor oder nach der Säule?

Der Fall
Totvolumen ist das Volumen der Apparatur außerhalb der Säule, in dem die Probe sich befindet; also, das Volumen vom Probengeber bis einschließlich Detektor – eben ohne Säule. Wir haben uns an dieser Stelle bereits mit dem Thema beschäftigt. Dennoch wird jenes insbesondere im Kontext mit Miniaturisierung und UHPLC weiterhin intensiv diskutiert. Deswegen möchte ich es erneut aufgreifen. Wie wichtig, wie „schlimm“ ist das Totvolumen nun tatsächlich?

Bild 1: Peakform von früh eluierenden Peaks an langen und kurzen Säulen, Ursache hier: großes Totvolumen der Apparatur (Details siehe Text).

Die Lösung
Heute möchte ich wenig schreiben, dafür umso mehr Bilder zeigen. Merke direkt Folgendes, was gleichzeitig bereits als Fazit der ganzen Diskussion gelten kann: Das Totvolumen ist wirklich wichtig nur bei früh eluierenden Peaks und isokratischen Trennungen und folgenden Säulendaten: ≤50 mm, 2,1 mm, ≤2…3 µm.

Kommen wir direkt zu einigen Beispielen: In Bild 1 wird eine isokratische Trennung mit einer 125 x 4 mm, 5-µm-Säule (links) und einer 50 mm, 2,1 mm, 1,9-µm-Säule (rechts) gezeigt. Der Fluss bei der langen Säule wurde bewusst ungünstig gewählt (rechts vom Minimum der Van-Deemter-Gleichung), bei der kurzen umgekehrt optimal – trotzdem: Das Totvolumen der Apparatur ist zu groß im Vergleich zum Säulenvolumen der kurzen Säule. Ergebnis: Dort breite Peaks.

Bild 2: Peakform an einer kurzen Säule im Gradientenmodus betrieben (Details siehe Text).

Bild 2 zeigt eine Gradiententrennung an der gleichen Apparatur mit der kurzen Säule. Die sehr gute Peakform bedarf keines weiteren Kommentars: Totvolumina stören bei Gradiententrennungen kaum.

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Bild 3: Einfluss eines Optimierungskits zur Reduktion von Totvolumina bei früh und spät eluierenden Peaks (Details siehe Text).

Bild 3 stellt ein Beispiel von Agilent dar: Das obere Chromatogramm ist aufgenommen an einer „üblichen“ 1290-Anlage (Totvolumen: 9,7 µl), unten nach Verwendung eines Optimierungskits (Totvolumen nun: 3,9 µl). Bei den Peaks, die früher als ca. 1 min eluieren, ist ein Unterschied in der Peakbreite schon merklich, ab 1 min kaum, d.h: Ein Optimierungskit „bringt“ für Trennungen, bei denen die Peaks später als ca. 1 min eluieren, kaum eine nennenswerte Verbesserung.

Bild 4: Zum Einfluss von Totvolumina im Falle von isokratischen bzw. Gradiententrennungen (Details siehe Text).

Bild 4 zeigt ein sehr schönes Beispiel von Monika Dittmann, entnommen aus [1]: Ein Totvolumen macht eine isokratische Trennung von vielen, früh eluierenden Peaks an einer Säule mit einem sehr kleinen Volumen zunichte (oberes Chromatogramm, „A“). Im Falle eines Gradientenlaufs lässt die Peakform – trotz des Totvolumens – kaum zu wünschen übrig (mittleres Chromatogramm, „B“). Die Eliminierung des Totvolumens führt schließlich auch unter isokratischen Bedingungen zu einer zufriedenstellenden Peakform (unteres Chromatogramm, „C“). Merke: Führst Du (auch) isokratische Trennungen unter Bedingungen wie hier beschrieben durch? In diesem Fall bestünde dringendster Handlungsbedarf: Optimiere Deine Anlage, wenn Du auch bei früh eluirenden Peaks eine gute Peakform möchtest!

Bild 5: Kleinvolumige Säulen liefern auch bei kurzen Gradienten Peaks mit einer guten Peakform (Details siehe Text).

Im letzten Beispiel (Bild 5) wurden zwei kontraproduktive Parameter gewählt, die additiv zu einander stehen und sich dadurch noch negativer bemerkbar machen: Einerseits ein „riesiges“ Totvolumen der Apparatur von 120 µl und andererseits ein „winziges“ Säulenvolumen von ca. 250 µl. Trotzdem ist die Peakform bei Gradientenläufen okay, siehe dazu das untere, gezoomte Chromatogramm eines 2-min-Gradientenlaufs. Vereinfacht gesagt: Es ist „schwierig“, bei Gradiententrennungen keine gute Peakform zu bekommen…

Bild 6: Einfluss eines größeren Volumens nach der Säule auf die Auflösung (Details siehe Text).

Nun zum letzten Aspekt: Ein Totvolumen nach der Säule – nachdem ja die Trennung bereits erfolgt ist – ist kritischer als vor der Säule, siehe dazu ein Beispiel von Frank Steiner (Bild 6): Ein um den Faktor 2 größeres Zellvolumen führt zu einer merklichen Verschlechterung der Auflösung.

Dr. Stavros Kromidas, Breslauer Str. 3, 66440 Blieskastel, www.kromidas.de

Das Fazit
Ich kann nur das am Anfang Gesagte wiederholen: Verschwende im Falle von Gradienten bezüglich Totvolumina keine Gedanken. Führst Du anspruchsvolle isokratische Trennungen durch, d.h. Trennungen mit „vielen“, sehr früh eluierenden, eventuell noch dazu kleinen Peaks an kurzen/dünnen Säulen mit Teilchen ≤2 µm, besteht wahrscheinlich dringender Handlungsbedarf. Denn bei kommerziellen, auch modernsten HPLC/UHPLC-Anlagen ergibt sich ohne Hardware-Optimierung in solchen Fällen ein Effizienzverlust von ca. 30…40 %! Das geben übrigens die Gerätehersteller (jedenfalls einige…) offen zu.

[1] Monika Dittmann: „Das Problem der externen Bandenverbreiterung in einer HPLC/UHPLC-Anlage“, in Stavros Kromidas (Hrsg.) „Der HPLC-Experte II – so nutze ich meine HPLC/UHPLC optimal!“, Wiley-VCH Verlag, 2015.


Ihr Stavros Kromidas

© by Stavros Kromidas
http://www.kromidas.de

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