Verstopfungen in HPLC-Säulen vermeiden

Die Präanalytik zur Aufreinigung der Probe spielt eine wesentliche Rolle bei der HPLC-Analyse, besonders bei komplexen Matrixproben wie z. B. Lebensmitteln oder Salben. Trinkwasserproben erweisen sich meist als wesentlich weniger problematisch.

Bei der Probenvorbereitung wird die Probe zunächst in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und in der Regel mittels Spritzenfiltern gefiltert. Dabei ist auf die Lösemittelbeständigkeit der entsprechenden Filter zu achten. Für wässrige, polare, hydrophile und mittelpolare Proben verwendet man RC-Filter. PA- oder Nylonfilter eignen sich sehr gut für mittelpolare, organisch-wässrige Lösungen, während PFTE-Filter sehr beständig gegen alle Lösemittel und aggressive Analyten sind und z. B. bei unpolaren Proben eingesetzt werden können.

Die Verwendung einer Vorsäule kann die Lebensdauer der analytischen Säule erheblich verlängern. Vorsäulen bieten den Vorteil, dass sie auch Moleküle zurückhalten, die eine irreversible Bindung mit dem Säulenmaterial eingehen würden. Besonders mithilfe von Vorsäulenkartuschen und Haltern werden Verunreinigungen und stark retardierende Substanzen in der Hauptsäule vermieden. Idealerweise ist die Vorsäule identisch zur Hauptsäule und stammt vom gleichen Hersteller. Um die analytische Säule vor Feststoffpartikeln zu schützen, kann man zusätzlich einen Vorsäulen-Filter verwenden. Der Filter hält Partikel aufgrund ihrer Größe zurück, so dass eine Akkumulation am Säulenkopf vermieden wird. Die im Filter verwendeten Fritten haben zumeist eine Porengröße von 2 – 0,2 μm, wobei mit kleiner werdenden Partikeln in der Säule auch Fritten mit kleinerer Porengröße zum Einsatz kommen.

Des Weiteren werden Inline-Filter in der HPLC-Analytik genutzt. Sie dienen dem Schutz der Anlage, wodurch sich Wartungskosten reduzieren. Inline-Filter können im HPLC-System an verschiedenen Stellen positioniert werden. Wird der Inline-Filter z. B. zwischen die Pumpe und den Injektor eingebaut, so werden Partikel und Verunreinigungen vom Eluenten entfernt. Ebenso wird der Abrieb der Kolbendichtung abgefangen, so dass das Rotorseal des Injektionsventils vor Abrieb und feinen Partikeln geschützt ist. Sowohl Filter als auch Vorsäulen sollten regelmäßig getauscht werden. Einen guten Hinweis auf den Zeitpunkt des Austausches gibt ein sukzessiver Anstieg des Rückdrucks.

Eluenten regelmäßig erneuern

Eine weitere Voraussetzung, um Verstopfungen der HPLC-Säule zu vermeiden, ist ein sauberer Eluent. Dabei gilt zu beachten, ein geeignetes Lösungsmittel mit dem passenden Reinheitsgrad wie HPLC grade, Gradient grade oder LC-MS grade etc. zu verwenden. Der Puffer sollte regelmäßig frisch hergestellt und weitere Partikel durch eine Filtration entfernt werden. Insbesondere selbst hergestellte Pufferlösungen müssen vor Gebrauch gefiltert werden. Vorsicht ist besonders bei wässrigen Eluenten geboten, da sich hier Mikroorganismen vermehren können.

Reinigung und Regeneration von HPLC-Säulen

Die ständige Analyse vor allem verschmutzter Proben führt zur Ansammlung von Verunreinigungen in der HPLC-Säule. Bei nachlassender Performance kann die Leistung der Säule zum Teil durch ein Spülprogramm wiederhergestellt und ihre Lebensdauer verlängert werden. Eine korrekte Reinigung verbessert die Reproduzierbarkeit von Analysen.

Verschiedene Anzeichen deuten auf die Notwendigkeit einer Säulenspülung hin: die Erhöhung des Drucks im Vergleich zur letzten Analyse oder eine Verschlechterung der Peakform. Ein weiteres Warnsignal ist die Verringerung der theoretischen Böden um mehr als zehn Prozent.

Für das Spülprogramm gilt analog zur chromatographischen Trennung: Apolare Substanzen werden durch apolare Lösungsmittel eluiert, polare durch polare. Am einfachsten lässt sich das Spülen durch einen Gradienten mit polarem und apolarem Laufmittel umsetzen. Je nach Art der Kontamination und des Säulenmaterials können die Verunreinigungen auch durch Injektionen von verdünnten Säuren, Basen oder stark apolaren bzw. polaren Lösungsmitteln gelöst werden. Um die Säule nicht irreversibel zu schädigen, sollte man vor dem Reinigungsvorgang im Säulenhandbuch nachschlagen, mit welchem Lösungsmittel bzw. Säuren oder Basen das Packungsmaterial kompatibel ist.

Hilft das reguläre Spülen nicht weiter, ist es einen Versuch wert, die Säule auch entgegengesetzt der Flussrichtung zu spülen. Bei UHPLC-Säulen mit kleiner Partikelgröße sollte geprüft werden, ob dies auch tatsächlich möglich ist. Es gibt Säulen, die am Säuleneinlass eine gröbere Fritte haben als am Säulenauslass. Das Spülen in entgegengesetzter Richtung kann dann zu einem Austritt des Säulenmaterials führen.

Lagerung von HPLC-Säulen

Nach Beendigung des Analyseprozesses ist es erforderlich, die nicht mehr benötigte HPLC-Säule in einem passenden Laufmittel zu lagern. Angaben dazu sind in der jeweiligen Produktinformation zur Säule zu finden. Alternativ kann die Säule im ursprünglichen Eluenten gelagert werden, den der Hersteller bei der Auslieferung verwendet hat. Dies gilt vor allem für stationäre Phasen auf Polymer-Basis. Je nach Material sind diese im Gegensatz zu den Silica-basierten Phasen mit organischen Lösungsmitteln nicht verträglich.

Besonders beim vorherigen Einsatz pufferhaltiger Eluenten muss die Säule vor der Lagerung mit einem Laufmittel gespült werden, das einen hohen wässrigen Anteil hat. Auf diese Weise werden Puffersalze entfernt, die sonst ausfallen und die Säule verstopfen würden. Das Spülen mit 100 Prozent Wasser kann manche RP-Säulen irreversibel schädigen.

Eine RP-Säule sollte immer in einem hohen Anteil organischen Lösemittels lagern, um mikrobielles Wachstum zu verhindern. Wird die Säule hingegen lediglich in eine andere Anlage eingebaut und die Analytik dort fortgeführt, kann man sich die obige Prozedur sparen.

Läuft eine Probensequenz mit mehreren Proben über Nacht, so wird der Ausfall von Puffersalzen vermieden, indem der Fluss auf einem niedrigen Niveau weiter durch die Säule fließt, auch wenn bereits alle Proben vermessen sind.

Sehr gute Lagerbedingungen für HPLC-Säulen sind bei Raumtemperatur von 15 bis 30 °C und einer üblichen Raumfeuchte zu Laborbedingungen. Man unterscheidet zwischen einer Kurzzeitlagerung von zwei bis drei Tagen und einer Langzeitlagerung von mehr als drei Tagen. Bei einer kurzfristigen Lagerung kann der Eluent in der Säule verbleiben, sofern er keine Pufferlösungen enthält. Methanol eignet sich nicht für eine Langzeitlagerung, sollte es durch Metallionen verunreinigt sein. Unabhängig vom Säulenmaterial muss für die Lagerung sichergestellt werden, dass die Verschraubungen fest sind und die Säule nicht austrocknen kann. Unter diesen Bedingungen lagern HPLC-Säulen lange Zeit, ohne an Trennleistung einzubüßen.